细菌耐药机制

1、细菌耐药机制研究进展浙江大学医学院从属第一医院俞云松第1页第2页第3页一、外膜孔蛋白降低或丢失细胞内抗生素浓度降低膜孔蛋白(OprD): 第4页细胞外膜上一些特殊蛋白是一个非特异性、跨越细胞膜水溶性物质扩散通道。膜 孔 蛋 白第5页革 兰 阴 性 细 菌 细 胞 膜第6页一些细菌本身存在膜孔蛋白较少或蛋白通道较小，使一些抗菌药品不能进入菌体内部，称为“内在性耐药”或“固有性耐药”（intrinsically resistant），即这种耐药并非是因为任何染色体突变或是耐药质粒取得所致。如铜绿假单胞菌细胞外膜上没有大多数革兰阴性细菌所含有经典高渗透性孔蛋白，它孔蛋白通道对小分子物质渗透速度仅为经

2、典孔蛋白通道1%。 “先天不足”第7页一些含有高渗透性外膜且反抗菌药品敏感细菌能够经过降低外膜渗透性而发展成为耐药菌，即原有孔蛋白通道因为细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失，则细菌就会对该抗菌药品产生很高耐药性。 亚胺培南是一个非经典-内酰胺类抗菌药品，主要是经过一个特殊孔蛋白通道OprD2扩散进入细菌，一旦这一孔蛋白通道消失，则产生耐药性。 “后天取得”第8页产气肠杆菌从亚胺培能敏感株变为耐药株第9页亚胺培南敏感及耐药产气肠杆菌PFGE图C1 C2:亚胺培南敏感C3 C4:亚胺培南耐药第10页亚胺培南敏感及耐药产气肠杆菌SDS图C1 C2:亚胺培南敏感C3 C4:亚胺培南耐药第11页PC

3、R扩增Omp36全长及序列分析IS903 98%（约1000bp)第12页插入序列引发OprD2缺失（铜绿）ISPa1328约bpOprD2第13页细菌产生一个或各种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细胞内抗菌药品，使之抵达靶位之前失去活性细菌产生灭活酶主要有： -内酰胺酶 氨基糖苷类钝化酶 氯霉素乙酰转移酶 MLS钝化酶二、 产生灭活酶第14页超广谱-内酰胺酶（ESBLs）高产AmpC酶碳青霉烯酶最主要耐药原因对-内酰胺抗生素造成威胁-内酰胺酶临床上最主要-内酰胺酶第15页是质粒介导能够水解头孢他啶、头孢噻肟等亚氨基-内酰胺类及氨曲南等单环酰胺类抗生素，并可被克拉维酸等-内酰胺酶抑制剂所抑制一类

4、-内酰胺酶。ESBLs在分子生物学分类中属于A类酶，在Bush分类中属于2be类酶。超广谱-内酰胺酶（extended-spectrum -lactamases，ESBLs）第16页ESBLs分类依据基因同源性不一样分为：TEM型 80SHV型 46CTX-M型 37OXA型 18其它型 20/studies/webt.htm.CTX-M-1组CTX-M-2组CTX-M-8组CTX-M-9组第17页中国400株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌基因型分布第18页32家医院 1994-年大肠杆菌及肺炎克雷伯菌产ESBLs百分率第19页头孢菌素酶 大部分肠杆菌科细菌如肠杆菌属菌种、弗劳地枸橼酸杆菌、摩根摩根

5、菌、普鲁菲登菌属菌种粘质沙雷菌等都能产生染色体介导AmpC酶。第20页 阴沟肠杆菌第21页ACT-1,DHA-1,CMY (Peking)DHA-1,CIT,ACT-1 (Shanghai) DHA-1 (Zhejiang)DHA-1,ACT-1 (GuangZhou)DHA-1 is The Predominant Type in ChinaMap of China第22页克隆片段PCR产物1100bp共6432bp ORF1ORF2ORF3ORF4ORF5ORF6IS26orf-1 DHA-1 ampR qacE1 sul15232 bp第23页指全部能显著水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯

6、类抗生素一类内酰胺酶分别属于Ambler分子分类中A类、B类、D类酶 。 碳青霉烯酶 第24页天然起源碳青霉烯酶嗜麦芽寡养单胞菌L1酶取得性碳青霉烯酶（Ambler分子分类）B类酶（金属酶）：IMP、VIM类及SPM-1A类酶：NMC-A、KPC-1、GES-2等D类酶：OXA-23至OXA-27、40、48、54碳青霉烯酶按其起源可分为第25页金属酶染色体编码金属酶：BC ，L1,TUS-1,MUS-1,Sfh-1,Mbl1b，大多起源于环境寄生菌。取得性金属酶：IMP VIM SPM GIM-1 SIM-1，位于可转移基因元件上，造成区域性传输。第26页IMP型金属酶IMP型金属酶GenB

7、ank上已公布21种，比较它们相互之间序列表明：IMP型金属酶大致能够分为两组： 1）IMP-1、IMP3-7、IMP911、IMP-16 2）IMP-2和IMP-8、12、13、19、20 第27页中国IMP-4 20香港 鲍曼 20广州 杨格枸橼酸杆菌 、铜绿IMP-1 12月 江苏无锡 铜绿IMP-8 2001 台湾 铜绿第28页VIM型金属酶VIM型金属酶 与IMP类金属酶同源性40，但两类金属酶动力学性质相同，编码基因都位于整合子上。 当前VIM型金属酶GenBank上已公布12种，比较它们相互之间序列可将VIM金属酶大致分为三组： 1）VIM-1、4、5、11a 2）VIM-2、3

8、、6、8、9、10、11b 3）VIM-7第29页VIM型金属酶分布VIM-1 1999年 意大利 铜绿 氧化木糖产碱杆菌 恶臭假单胞 希腊 大肠 肺克 法国 肺克VIM-2 2000 法国 铜绿 意大利 希腊 日本 韩国 葡萄牙 西班牙 波兰 克罗地亚 智利 阿根廷 美国 中国VIM-3 台湾地域 铜绿VIM-4 年 希腊 铜绿 瑞典 铜绿 意大利 肺克 阴沟 波兰 铜绿第30页VIM-5 土耳其 肺克 铜绿VIM-6 新加坡 恶臭假单胞VIM-7 美国 铜绿VIM-8 哥伦比亚 铜绿VIM-9，10 英国VIM-11 阿根廷 意大利VIM型金属酶分布第31页亚胺培南耐药铜绿假单胞菌金属酶检

9、测结果北京（27）上海（32）杭州（27）广州（32）成都（22）金属酶表型阳性菌株数35310百分率11.115.611.13.10.0金属酶基因型阳性菌株数36410百分率11.118.814.83.10.0第32页 VIM-2基因整合子结构图A： B2， B3， B28， H19， H26， H54， G4 结构同In72B： S5， S9， S10， S11， S12（S15、H22除外） intI1 attI1 aacA4 59-b VIM-2 59-be aadB 59-be 3-CS intI1 attI1 aacA4 59-be VIM-2 59-be 3-CSAB第33页 H

10、22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b2 b3 b28 w19w54Marker50kbAB H22H26 g4 s5 s9 s10 s11 s12 s15 b2 b3 b28 w19w54MarkerPFGE谱分析结果：共有七种类型，来自上海六株为同一类型，来自北京三株分两个类型，来自杭州四株一样也分两个类型。各地域之间类型各不相同。重复尝试经过接合试验及质粒抽提物电转化传递金属酶基因均未获成功。经XbaI内切酶消化染色体PFGE与VIM-2探针杂交显示其中10株铜绿假单胞菌50-kb大小酶切片段杂交阳性，而其余3株（H22、H26、B2）没有阳性片段。第34页类酶

11、包含阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌中由染色体介导NMC-A、Sme-1Sme-3、IMI-1酶，以及肺炎克雷伯菌中质粒介导KPC-1-4酶、铜绿假单胞菌中质粒介导GES-2酶。碳青霉烯类抗生素水解酶第35页二株产IMI-1阴沟肠杆菌PFGE结果第36页AntibioticsMIC(mg/l)E cloacaeE C600 E.coli C600E8 E.coli DH5E.coli pT103Imipenem320.38320.2532Ciprofloxacin0.0640.250.250.006008Amikacin4220.250.38Cefepime20.0640.0640.1250.047Ce

12、ftazidime160.50.380.50.25Cefotaxime120.050.1250.0940.047Cefoperazone2560.51.50.0474Cefoperazone/Sulbactam1280.25262Piperacillin/Tazobactam2562424Ticarcilliin/ClavulanicAcid2561232432Ampicillin/Sulbactam2568641.5NDE cloacae 8, E C600, E.coli C600E8，E.coli pT103和E.coli DH5反抗菌药品体外抗菌活性第37页阴沟肠杆菌、接合菌质粒电泳图

13、谱 M1A B M2 54kb 15kb第38页Schematic representation of the cloned E.coRfragmentIS903IMI-2Imi-2RIS903IS2903bp 921bp 882bp 876bp 921bp10629bp(GenBank accession number : AY780889 )Imi-R与ImiR同源性为97%。IMI-2与IMI-1同源性99%，仅在37位由天冬氨酸天冬酰胺，106位由组氨酸酪氨酸 第39页抗菌药品肺炎克雷伯菌亚胺培南32亚胺培南/克拉维酸16美罗培南32美罗培南/克拉维酸16厄他培南256头孢他啶256头

14、孢他啶/克拉维酸256头孢噻肟256头孢噻肟/克拉维酸256头孢吡肟256头孢曲松256头孢西丁256氨曲南256头孢哌酮/舒巴坦256哌拉西林/三唑巴坦256环丙沙星32阿米卡星256多重耐药肺炎克雷伯菌第40页转化试验抽提亚胺培南耐药肺炎克雷伯菌质粒转化DH5，在含1g/ml亚胺培南MH平板上筛选成功筛选到亚胺培南耐药转化菌（转化质粒约60kb）染色体带61kb第41页PCRPCR筛选内酰胺酶耐药基因包含TEM-1、SHV、CTX-M-1、CTX-M-9、OXA-48、VIM 、 OXA-10和KPC-1以肺炎克雷伯菌质粒DNA为模板PCR阳性为TEM、SHV和KPC转化菌和克隆菌只有KP

15、C阳性PCR产物测序分别为TEM-1、SHV-12和KPC-2第42页转化菌质粒（亚胺培南耐药基因克隆）EcoR, Hind，Nhe等酶切NhepTeasy VectorpTeasy Vector1.5kb在含亚胺培南1g/ml MH平板筛选第43页克隆片段测序对重组质粒插入片段进行步移测序，取得1554bp核苷酸 DNAssist软件分析，1个开放读码框(ORF)经GenBank Blast程序分析，该ORF与KPC-2 (GenBank注册号:AY210886) 核苷酸序列同源性为100% 第44页D类酶 （OXA酶）在Bush分群中属于2d类，对苯唑西林水解活性很强。OXA型碳青霉烯酶对

16、亚胺培南水解活性较低，对头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南水解活性也很弱。除OXA-23外，其它酶能被三唑巴坦、克拉维酸抑制。OXA型碳青霉烯酶编码基因可位于质粒或染色体上，或定位在I型整合子基因盒中，具备向其它菌种转移能力 碳青霉烯类抗生素水解酶第45页blaOXA-23-like,blaOXA-51-like是我国鲍曼不动杆菌最主要碳青霉烯酶，ISAba1与OXA基因表示和转移亲密相关342株亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌中339株检测到最少一个OXA基因，303株检测到OXA-23-like和OXA-51-like基因，22株只检测到OXA-23-like基因，17株只检测到OXA-51-like基因

17、；其中在313株菌株OXA-23-like基因上游34bp处检测到ISAba1，在13株菌株OXA-51-like基因上游7bp处检测到ISAba1。第46页氨基糖苷类钝化酶分为： 磷酸转移酶（APH） 乙酰转移酶（AAC） 核苷转移酶（ANT）氨基糖苷类钝化酶作用机制： 三者分别使抗生素羟基磷酸化、氨基乙酰化和羟基核苷化，使之不能再与细菌核糖体结合。氨基糖苷类耐药第47页庆大霉素高水平耐药（HLGR ） 主要耐药机制 氨基糖苷类修饰酶 耐药基因 百分率 AAC(6)-Ie-APH(2)-Ia aac(6)-Ie-aph(2)-Ia 90% APH(2)-Ic aph(2)-Ic APH(2)

18、-Id aph(2)-Id APH(2)-Ib aph(2)-Ib 10%氨基糖苷类耐药第48页8,724bpORF1ORF2ORF4ORF353ISEcp1 (tnpA) aph-Ie repD str部分序列 一个新质粒介导肠球菌氨基糖苷类耐药基因aph(2”)-Ie第49页三、靶位改变第50页主要抗菌药品作用靶位-内酰胺类 青霉素结合蛋白（PBP）氨基糖苷类 核糖体30S亚基大环内酯类 核糖体50S亚基氟喹诺酮类 DNA旋转酶（拓扑异构酶 ）、拓扑异构酶糖肽类 D-丙氨酰D-丙氨酸四环素类 核糖体50S亚基 第51页PBP2a作用PBP2a与-内酰胺抗生素亲和力低，替换正常PBP功效 8

19、7KdaPBP1 80 PBP2 78 PBP2a 75 PBP3 70 PBP3 41 PBP4第52页第53页第54页DRIRIRDRSCCmecccrAccrBmecImecR1mecAorfXJ1J3J2SCCmec第55页第56页IV型第57页VSHA-MRSACA-MRSA 高 耐药性 较低 阴性 PVL 阳性I、II、III SCCmec IV、V第58页金葡菌耐药性发展历程S. aureusPenicillin-resistantS. aureusMethicillin-resistantS. aureus (MRSA)PenicillinMethicillinVancomyc

20、in-resistantenterococcus (VRE)Vancomycin (glycopeptide)-Intermediate-ResistantS. Aureus （VISA、GISA）Vancomycin-ResistantS. Aureus（VRSA）Vancomycin19401960s1990s1996Superbugs第59页氟喹喏酮耐药机理拓扑异构酶 IV(parC, parE)拓扑异构酶 II (gyrA, gyrB)左氧氟沙星氟喹喏酮第60页糖肽类抗生素包含万古霉素、替考拉宁等，是高分子量疏水性化合物。主要耐药机制： VRE细胞壁肽糖前体末端D-丙氨酰-D-丙氨酸发

21、生了改变，万古霉素不能与之相结合，所以不能抑制VRE细胞壁合成。 耐万古霉素肠球菌（VRE）第61页transposaseresolvasevanRvanSvanHvanAvanX6590bp (ZY02, HS3 )表示PCR扩增vanYvanZ10Kb （ZY01）转座功效（转座酶transposase基因和解离酶revolsase基因，分别编码产生转座酶和解离酶在转座过程中发挥作用）调控耐药基因（VanR和VanS）产生耐糖肽类缩肽（VanH脱氢酶、VanA连接酶和VanX二肽酶）辅助蛋白（VanY和VanZ）含VanA基因簇转座子转座入各种质粒，或经过接合转座造成VRE耐药性传输 第6

22、2页大环内酯类耐药机制核糖体靶位点改变: erm 编码，高耐; 法国、西班牙、中国主动外排泵: mef 编码，低耐 ，加拿大、美国、修饰酶第63页16S rRNA甲基化酶氨基糖苷类抗生素作用位点：细菌16S rRNA以往认为最主要氨基糖苷类抗生素耐药机制：修饰酶，作用位点在药品，引发一个或几个药品耐药最新发觉一类新氨基糖苷类抗生素耐药机制： 16S rRNA甲基化酶，引发药品作用位点甲基化，造成细菌对全部氨基糖苷类抗生素高水平耐药，当前发觉4种：armA、rmtA、rmtB、rmtC多重耐药鲍曼不动杆菌在我国各省市广泛流行，该菌对氨基糖苷类抗生素耐药率和耐药水平高16S rRNA甲基化酶是否在

23、介导该菌对氨基糖苷类抗生素耐药中发挥作用需要系统研究第64页700株鲍曼不动杆菌对5种氨基糖苷类抗生素体外抗菌活性5种氨基糖苷类抗生素耐药率均大于60；377株（53.9）菌株对5种氨基糖苷类抗生素均耐药；334株（47.7）菌株armA阳性；armA阳性菌株对上述全部氨基糖苷类抗生素均高水平耐药,MIC256mg/L 重复进行接合试验、质粒抽提、电转化均未成功 Southern-blot杂交证实armA基因位于克隆A、B、C约220kb、300kb、220kb大小染色体ApaI酶切条带上armA基因定位于鲍曼不动杆菌染色体第65页四、主动外运 有些抗菌药品（常见如四环素类及喹诺酮类）能诱导细

24、菌主动外运，抗菌药品难以在细菌内积累到有效浓度，造成反抗菌药品耐药程度普遍提升。第66页外排泵结构外排系统由3个部分组成：位于内膜肿瘤耐药分化家族(resistantnodulationdivision family，RND)质膜转运体内外膜之间膜周连接蛋白或膜融合蛋白(MFP)位于外膜孔道形成蛋白(0EP) 第67页组间外排泵表示量均值比较第68页 是指细菌粘附于固体或有机腔道表面，形成微菌落，并分泌细胞外多糖蛋白复合物将本身包裹其中而形成膜状物。其生化组成为藻酸盐多糖和蛋白复合物。菌膜可阻止巨噬细胞、抗体、药品作用于菌体五、细菌生物被膜（Biofilm）第69页生 物 被 膜第70页 细菌

25、形成生物被膜后，往往反抗菌药品产生高度耐药性，原因有细菌生物被膜可降低抗菌药品渗透吸附抗菌药品钝化酶，促进抗菌药品水解细菌生物被膜下细菌代谢低下，反抗菌药品不敏感生物被膜存在阻止了机体对细菌免疫力，产生免疫逃逸现象，减弱机体免疫力与抗菌药品协同杀菌作用第71页其它耐药机制缺乏自溶酶替换路径酶过量产生等靶位保护机制第72页质粒介导喹喏酮耐药 1998年George.A.Jacoby等从一株肺炎克雷伯菌（UAB1）中发觉能介导各种抗生素耐药质粒pMG252，经接合传递后其接合子对环丙沙星耐药性增加近30倍(MIC 0.0080.25g /mL)。 在该质粒内发觉了喹诺酮耐药（quinolone r

26、esistance）基因，命名为qnr (Lancet1998; 351: 79799) 第73页作用机制保护DNA旋转酶Qnr经过与旋转酶特异地结合从而影响酶内在活性,降低了酶与DNA结合,造成喹诺酮类药品作用靶位数量降低Qnr与旋转酶结合,改变了药品结合区域构象,从而降低了药品识别靶位效率保护拓扑异构酶细菌对拓扑异构酶保护作用与DNA旋转酶类似Hegde, S.S. et al. Science 308:1480, QnrDNA旋转酶第74页表 5株qnrA阳性大肠埃希菌及其接合菌MIC值菌株CIPNOROFXMOXCTXCAZSGENAKAMP6312825664322561621225

27、6Tc631410.52564414256140642566432322888256Tc1401421162884256142484162564424256Tc1420.50.511322882256Z8161616321284256256256256TcZ80.060.060.1250.06128464256256256Z11326416321284256256256256TcZ110.060.060.1250.0664464256256256J53 0.015 0.125 0.125 0.03 0.06 0.1254 1 1 2 J53为受体菌第75页表3 8株qnrA阳性肺炎克雷伯菌及其

28、接合菌MIC值菌株CIPNOROFXMOXCTXCAZSGENAKAMP14-26412864128322111256Tc14-20.250.510.251622212562564256643225616422256Tc2518121284414256316425612812825616212256Tc31181225684122569628221282428256Tc961812256841425615181684644428256Tc1511110.25321212256152864441282428256Tc1520.520.50.56414142561533212816163264256256256256Tc1530.51121612122561564821644428256Tc1562820.2564441425