无菌微生物限度检查与方法验证

1、无菌、微生物程度检验及方法验证第1页微生物试验室质量管理一、试验室设施与设备和管理（法规要求）无菌检验、微生物程度检验与抗生素微生物检定试验室，应严格分开。无菌检验、微生物程度检验试验室分无菌操作间和缓冲间。无菌操作间应具备对应空调净化设施和环境，采取局部百级办法时，其环境应符合万级洁净度要求。进入无菌操作间应有些人流净化和物流净化设施。无菌操作间应依据检验品种需要，保持对邻室相对正压或相对负压，并定时检测洁净度。无菌操作间内禁放杂物，并应制订地面、门窗、墙壁、设施等定时清洁、灭菌规程。无菌检验在洁净度100级单向流空气区域内进行，其全过程应严格恪守无菌操作，预防微生物污染。单向流空气区与工作

2、台面，必须进行洁净度验证。微生物程度检验全过程，均应恪守无菌操作，严防再污染。第2页微生物试验室质量管理为满足微生物学试验要求，微生物试验室应含有：严格分开无菌检验、微生物程度检验、无菌采样室。菌种处理与微生物判别室有局部百级办法。各自分开抗生素微生物检定、细菌内毒素检验、抗菌作用测定半无菌室。培养室（普通为100，000级）。试液及培养基配制室。灭菌室。试验器皿洗涤、烘干室。人员办公休闲室。试验用具、易耗品储备室。第3页微生物试验室质量管理设施和设备管理特殊标准品菌种培养基、缓冲液、试剂消毒剂文件管理培训内审第4页微生物试验室质量管理微生物室试验室质量管理制订洁净室（无菌室）使用管理规程（S

3、OP）菌种处理相关标准操作规程（SOP）生物安全柜使用标准操作规程（SOP）带菌废弃物处理标准操作规程（SOP）环境消毒标准操作规程（SOP）环境清洁、消毒标准操作规程（SOP）试液及培养基配制标准操作规程（SOP）试验器皿洗涤标准操作规程（SOP）建立无菌室使用登记册使用日期，时间，使用人，设备运转情况，温、湿度，洁净度情况（沉降菌数、浮游菌数、尘埃粒子数），报修原因，报修结果，清洁工作（台面、地面、墙面、天花板、传递窗、门把手），消毒液名称等第5页微生物试验室质量管理试验室使用管理天天工作前用消毒液消毒工作台，开紫外灯（最少半小时）进行空气消毒，每个月定时做彻底清洁工作，适当初用消毒剂进行

4、熏蒸。非必要品禁止带入试验室，必要资料和统计应消毒后进入并应远离操作台。试验人员进入洁净室（无菌室）不得化装、戴手表、戒指等首饰；不得吃东西。应严格按更衣程序更衣。统计温湿度是否在要求范围内，每次试验时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数并统计；如发觉问题应找原因，及时报修和汇报并将报修原因和结果统计归档。如遇停电，应立即停顿试验，重新进入无菌室前，最少开启机房运转1小时以上。在每次试验结束时，应用消毒剂及时按消毒规程中要求消毒操作台和洁净室（区），并开启室内紫外灯以杀灭存留微生物。使用后器具如平皿、试管，全部微生物培养物，染菌/带菌物品等应用消毒液浸泡（最少二十四小时以上），经煮沸或灭菌后

5、清洗或丢弃。第6页微生物试验室质量管理洁净室（无菌室）使用管理每季度定时进行清洁度再验证，以确保洁净度符合要求，保留原始统计及趋势分析资料，定时归档保留。最少每年一次定时更换新紫外灯管并统计，以确保紫外灯管灭菌连续有效，定时归档保留。最少2年1次，或按洁净度验证实际情况，定时更换初效、中效、高效头。以确保净化系统功效连续有效，并同时在使用登记本上做好更换统计。定时归档保留。平时试验室内应尽可能降低人员走动或活动，通向洁净室门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。发觉洁净度不符合要求时，应马上停顿使用，寻找原因，彻底清洁、消毒，须经清洁度再验证符合要求后，才再使用，并将情况统计在无菌室使用登记

6、册上，定时归档保留。非微生物室检验人员不得进入洁净室（无菌室），对必须进入外来人员或维修人员应进行指导和监督。第7页微生物试验室质量管理一、试验室设施与设备和管理设施洁净室、净化工作台、生物安全柜。设备高压蒸汽灭菌器、电热恒温干烤箱、培养箱、冰箱。试验仪器全封闭薄膜过滤装置、电动匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心机、显微镜，及刻度吸管、试管、三角烧瓶、培养皿等。建立主要设施、设备、仪器明细统计，内容包含名称、型号、生产厂家、购置日期。质量确保档案：购置发票、安装验收或开箱验收统计、调试统计、计量检定或运行校验合格证、指定专员负责、制订标准操作规程（SOP）、建立使用登记册，维修、保养统计、改造或更新

7、统计、直至报废统计。第8页微生物试验室质量管理一、试验室设施与设备和管理定时监测生物安全柜和（或）超净工作台内表面微生物学质量及其内部空气质量（粒子和微生物）。使用时检验压差指示表。培养箱、冰箱需在设备每个腔室内放置经校准过玻璃温度计，天天检验设备腔室内温度情况而且在日志上做好对应统计。定时回顾每个设备温度统计数据，以考查设备运行状态。定时用中性清洁剂或消毒剂清洗培养箱（或室）、冷藏箱（或室）、冷冻冰箱及水浴腔室内表面。高压灭菌柜、电热恒温干燥箱等需要验证和连续监控。仪器校准和确认。第9页微生物试验室质量管理需要确认和验证试验和连续质量监控设备高压灭菌柜和电热恒温干燥去热原烘箱安装确认（IQ）

8、：要确认控制系统及其他仪器仪表设计是否得当并经过校验。检查有关共用介质（如蒸气、水和空气等）符合灭菌工艺要求。运行确认（OQ）：要求证明空载状态下验证方案中所述腔室内全部关键位置温度是否均处在规定范围内。建立热分布图谱。空载状态下，湿热灭菌当腔室工作温度不低于121时，各点温度与腔室内平均温度之差不超过1 ，于热除热源，当运行温度不低于250 时，腔室内温差应不得超过15 。性能确认（PQ）：要求在满载条件，温度探头插入待灭菌物品内部，同时加入一定浓度微生物或独立生物指示剂。对不一样工艺条件（物品、包装和装载方式、灭菌参数等），分别进行性能确认试验，包括热穿透试验和生物指示剂挑战试验。包含：高

9、压灭菌柜、除热源电热恒温干燥箱、自动微生物判别系统和计数系统。第10页微生物试验室质量管理品种：520倍稀释碘伏水溶液0.10%新洁尔灭轻易1:5084消毒液75%乙醇溶液3%碘酒溶液5%石碳酸（来苏儿）消毒溶液2%戊二醛水溶液尼泊金酒精消毒液等应定时更换消毒剂品种，按标准准确配制。清洁、消毒剂管理第11页微生物试验室质量管理一、菌种保留与管理菌种特殊标准品 应保持基生长特征和降低污染，是微生物试验结果一致性主要确保。制订菌种保藏管理制度 微生物试验室应制订菌种保藏管理规程来规范菌种起源、申购、保管、转种传代、存放和领用等方面要求，确保菌种溯源性和稳定性；预防试验用菌种因屡次传代而失去经典生物

10、学特征发生变异或死亡，确保菌种长久正确、稳定，从而确保试验灵敏度和重现性。菌种名称：金黄色葡萄球菌菌种系列号：CMCC(B)26003传代次数：第 4 代有 效 期： 年 月 日 制备日期： 年 月 日 传 代 人：王熙凤第12页微生物试验室质量管理菌种保留应有专员负责，加锁保留于冰箱中。试验室标准菌株应来自CMCC（中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心或ATCC（美国菌种保藏中心）等国际法定菌种保藏机构。有接收、确认统计。菌种转种等均应在超净工作台进行，以防污染。各种菌种应按要求时间接种，全部保藏菌种均应贴有对应标签，有菌种清单。第13页验证试验惯用菌种枯草芽孢杆菌 CMCC（B）6350

11、1金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26003生孢梭菌 CMCC（B）64941铜绿假单胞菌 CMCC（B）10104大肠埃希菌 CMCC（B）44102乙型副伤寒沙门菌 CMCC（B）50094白色念珠菌 CMCC（B）98001黑曲霉 CMCC（B）9 003第14页菌种保藏步骤干燥菌种复苏，划平板挑选特征经典纯菌菌落；（制菌悬液使用）确定保藏合格菌体形态；选择最适宜保留方法，定时对保藏菌种进行检验，观察是否发生改变，若有改变，须改变保藏方法。保藏期满应及时进行移种。第15页菌种接收标准菌种普通是玻璃安平装冻干粉剂接收时应检验名称/数量和完整性。贴好标签后储存于-20普通安平冻干品可在5年之内

12、使用使用时应按（菌种保藏中心提供）相关资料要求进行复溶、培养和保留。第16页菌种复活菌种复活用70%酒精擦拭清洁安瓿，自然风干用一小砂轮在安瓿上部划一条线，用手轻轻将安瓿开无菌操作，用一无菌吸管无菌移取12ml适宜液体培养基到瓿中；轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解；用无菌吸管将安瓶内菌液转移到对应液体培养基中，依据不一样菌种类型而将其培养于相宜温度下24-72小时。菌种确实认 菌种复活后，应确认菌种纯度与特征从培养肉汤中取细菌培养物接种到平板上，上划线分离出单个菌落。培养后观察其是否含有经典菌落形态然后挑取单一纯菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色特征及菌形。最终再做生

13、化试验以深入判定该菌种，或用API判定系统做判定工作。对已经过判定确认菌种就能够进行菌种传代和保藏了。第17页菌种传代和保藏菌种保藏方法使菌种代谢处于最不活跃或相对静止状态，从而在一定时间内不发生变异并保持生命活力。普通来说，低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低三个主要原因不论使用那种菌种保藏方法，都应进行验证，以确保在对应保留条件下菌种不会变异而且性能稳定。菌种传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超出5代（GMP，药典）将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次即称为“一代”。第18页冷冻真空干燥保藏法 主要是将待保藏菌种混于有保护作用介质内制成菌液，分装在安瓿中于冷冻条件下使其快速冻

14、结，因冻结可使晶型细致，不致损伤活菌细胞。然后用真空抽气减压，是安瓿内冰晶液体升华，水气快速被真空抽走，冰晶型菌液很快变成疏松干燥固体物，最终在真空状态下熔封管口，使干燥物在局部真空条件下封存，并置冷暗处，在很长时间内菌种仍可维持活力不变。第19页甘油冷冻管保藏法将待保藏菌接种至平板或琼脂斜面，培养用无菌接种环轻轻刮取菌台，用接种环使细菌充分扩散到预先装于试管中无菌蒸馏水中调整菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第10号管向已制备好菌悬液中加入等体积、浓度为20%无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。轻轻振摇小管，使内容物充分混合，分装于无菌小试管。制好甘油冷冻管最好在-30条件下贮存。使用期最少为2年。

15、氧细菌和酵母菌可用此法保藏，霉菌和厌氧菌则不适于用此法保藏。第20页液体石蜡覆盖保藏法将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中培养，无菌操作在层流台下用无菌吸管吸收无菌液体石蜡至培养好菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm，将试管直立，置于28冰箱中或室温下保留，如铜绿假单胞菌。此法保藏霉菌、放线菌、芽胞杆菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏12年，普通无芽胞细菌也可保藏1年左右。此法制备简单，不需要其它特殊设备，而且效果好，是传代培养变相方法，可适当延长保藏时间。第21页琼脂斜面低温保藏法保藏法（厂家惯用）将菌种接种在适宜固体斜面培养基上，生长充分后，移至28冰箱中保藏。保藏时间：霉菌、放线菌及芽胞菌保

16、留24个月，移种一次；酵母菌2个月移种一次；细菌最好每1月移种一次。优点：操作简单，使用方便，不需特殊设备，对大多数微生物都适用。缺点：保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。此法为试验室工作用菌种最惯用保藏方法，仅能用于工作用菌种短期保藏。第22页保藏芽胞液对产芽胞微生物宜制成芽胞菌悬液后再保藏，无菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培养皿内，轻轻转动使菌液均匀分布于培养基表面。将培养皿在适当温度下培养。普通需要7天或更长时间在层流台下，取35ml氯化钠磷酸盐缓冲液（pH7.0）加入培养皿内用无菌玻璃L棒轻轻刮下菌苔，注意不要划破培养基。用无菌注射器或无菌吸管吸收菌悬液，搜集于试管中。将搜集

17、芽胞液放在8090水浴中加热15分钟，冷却。做好标识，放至28冰箱中保藏。原始芽胞液可保留1年。每次使用前用平皿法重新标定其浓度。第23页微生物菌种传代保藏过程按菌种说明书要求复溶菌粉菌（标准菌株），转种于适当增菌培养基内（此为第一代G1），复壮后转接至平板上，并于适当温度下培养适当初间，分离出单个纯种菌落（此为第二代G2）菌种判定完成后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，冷冻或低温保留（标准贮备菌株G2）；同时挑取纯菌落转接斜面菌种作为工作用菌种（工作菌株W3），于适当温度下培养适当初间后可用于试验，直至转为W5为止，需重新开启安瓶，再重复上述操作程序。菌种被分为两类，传代用菌种和工

18、作用菌种，传代用菌种（标准贮备菌株）用甘油冷冻管法保藏工作用菌种（工作菌株）用斜面低温保藏法保藏第24页试验用菌液制备传代：取菌液0.1ml接种至10ml液体培养基，按要求培养、稀释对照用菌种在使用过程中，亦应检验其生物学特征。如菌落形态（在可能情况下，用选择性培养基进行生长检验）、革兰染色、镜检菌体形态、主要生化特征（必要时应作菌种判定试验）。如发觉染菌或或变异，衰退等现象时，应及时处理。为确保试验可靠性和准确性，试验室还应严格按摄影关规程制备和使用菌种，并对每种微生物存贮条件（需/厌氧状态、温度和时间）进行确认。室温下菌悬液应在制备后2小时内使用低温保留（2-8）时细菌和酵母菌菌悬液应在制

19、备后二十四小时内使用霉菌孢子液则应在制备后7天内使用（黑曲霉孢子悬液可保留在28 ，在验证过贮存期内使用）在使用时（在二十四小时之内）均应同时进行菌数复核检验。试验时可采取分光光度法或麦氏比浊法预计菌液浓度。第25页菌种制备、保藏和使用统计1、菌种名称_菌种系列号_菌种起源_ 试验室编号_传代代数_2、菌种制备：培 养 基_批号_接种日期_ 接种容器_数量_培养条件_温度_时间_ 纯化分离判定结果_操作人_日期_3、菌种保藏方法_保藏数量_保藏用培养基_批号_ 培养条件 温度_时间_使用期_操作人_日期_4、菌种使用统计序号支取日期数量操作人用途处理当菌种超出使用期或被污染以后应灭菌后丢弃。

20、是 否说明：试验室菌种编号标准：名称+传代代数+制备日期第26页培养基管理普通采取购自中国药品生物制品检定所合格商品脱水培养基。同时按照使用说明书进行配制，需注意培养基pH值应符合要求，不然必须校正后，按说明书要求灭菌。商品脱水培养基应在使用期内使用，使用前应注意查对名称，检验外观，遇有结块、吸潮现象，应废弃。新鲜培养基配制，应按质量标准要求配方进行，对培养基原材料要进行挑选，试剂应为化学纯试剂规格。制成培养基要求无沉淀。必要时以适当方法过滤，调整pH值，分装灭菌备用。灭菌：应经验证合格灭菌程序（一定装载方式下灭菌方法和条件）。验证：无菌性试验，促生长试验，灭菌器蒸汽循环系统。第27页培养基质

21、量控制建立质量控制程序全部配好培养基均需进行质量控制（pH、适用性检验试验）培养基使用期确实定：定时稳定性检验以确定使用期（225，避光，非密闭容器3周内使用，密闭容器1年内使用。质量控制频率：用同1批脱水培养基，采取经验证配制和灭菌方法制备培养基，可只做1次灵敏度检验。质量控制菌株选择（营养、灵敏、代表性）对无菌培养基无菌性、灵敏度检验与对照培养基进行比较无菌检验用需气厌气培养基指示剂氧化层不得超出培养基深度1/5，不然须经水浴煮沸10分钟，但只限加热一次。无菌检验结束时，指示剂氧化层应不超出培养基深度1/2。大肠埃希菌检验用MUG培养基配制前应挑选无荧光试管进行配制，观察结果时应用同批培养

22、基配制空白管和阳性菌管同时观察。第28页培养基灵敏度检验：已知菌生长试验细菌组：取每管装量为12ml硫乙醇酸盐液体培养基9支，分别接种小于100cfu试验菌各2支； 菌种： 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌空白对照：另一支不接种，培养2472小时逐日观察结果霉菌组：取每管装量为9ml改良马丁液体培养基5支，分别接种小于100cfu试验菌各2支； 菌种： 白色念珠菌 黑曲霉空白对照：另一支不接种，培养5天逐日观察结果结果判定空白管培养基无菌生长加菌培养基管均生长良好判灵敏度检验合格。第29页培养基管理配制好培养基，按无菌要求进行灭菌。培养基配制须有统计，统计内容含有：配制日期

23、和配制人员标识；培养基/溶液类型、体积；成份、每个成份物质含量、制造商、批号；pH（最初和最终）值无菌办法，包含实施方式、时间和温度。按日期编制灭菌后培养基编号将制备完成培养基按品种放置在阴凉指定位置，备用。注意保留期第30页灭菌法湿热高压蒸汽灭菌法：依115、121 或132 ，应用于培养基灭菌、试验器械、工作服、橡胶物品和试验室废弃物，也可用于玻璃器皿灭菌。普通121 30min干热法：利用物理学，171 -1小时，160 -2小时、121 -3小时：玻璃器皿湿热：蛋白质轻易凝固干热：氧化第31页检验方法学验证：在化学测试中，药品测定方法需要验证，与此对应，当建立药品无菌、微生物程度检验法

24、时，也应进行分析方法验证，以证实所采取方法适合于该产品无菌、微生物程度检验。证实采取药典某种方法和检验条件，在该供试品检验量、检验条件下，无抑菌活性或活性已消失，确保检验结果准确性。第32页检验方法学验证：验证时机；建立检验方法时；修订检验方法时；组分和检验条件发生变更时；定时再验证。第33页人员人是无菌药品生产中主要污染源，在管理比较到位。生产设备自动化程度很好，操作人员素质较高企业，人员操作所致污染率超出70%。具微生物专业知识经无菌技术培训对试验结果能进行充分全方面评价。第34页其它主要影响原因药品本身抑菌性；培养基促菌生长能力；培养条件（温度、湿度及需氧或厌氧）；过滤系统材质第35页检

25、验进展强调检验过程控制，提升检出率，确保检验结果可靠性。人员要求环境、设施要求培养基适用性检验数量方法验证培养时间试验用菌全封闭过滤培养器、隔离系统第36页检验结果确保要求有一个取样计划来涵盖整个批号有足够取样量和检验量选择适用培养基采取经验证无菌检验方法良好环境监控人员确保第37页无菌检验第38页无菌检验定义：无菌原料药是指法定药品标准中列有没有菌检验项目标制剂和原料药，包含无菌制剂和无菌原料药。无菌检验是检验要求无菌药品、医疗器具、原料、辅料以及要求无菌其它物品是否染有活菌一个方法。符合无菌检验法要求仅表明了供试品在该检验条件下未发觉细菌和真菌污染。无菌检验法建立在批产品受微生物污染是均匀

26、假设上（其实非均匀）。无菌检出低污染概率极低。所以，无菌检验存在风险和不足。第39页无菌检验不足无法对整批产品进行100%检验只进行细菌和真菌检验培养基培养条件（如温度和时间）是有限我们工作环境及操作是在相对无菌状态。第40页无菌检验：注射剂、植入剂、部分外用药鼻用制剂：用于手术或创伤鼻用制剂。凝胶剂：用于严重创伤凝胶剂。乳膏剂：用于烧伤或严重创伤乳膏剂。新增无菌检验中药制剂散剂：用于烧伤或严重创伤外用散剂。鼻用制剂：用于严重创伤鼻用制剂。眼用制剂：用于伤口眼用制剂。软膏剂：用于烧伤或严重创伤乳膏剂。气雾剂、喷雾剂：用于烧伤或严重创伤气雾剂、喷雾剂。第41页GMP取样取样注意事项，包含为降低取

27、样过程产生各种风险所采取预防办法，尤其是无菌或有害物料取样以及预防取样过程中污染和交叉污染注意事项；在生产每一阶段，应该保护产品和物料免受微生物和其它污染。附录1无菌药品 质量控制第八十条 无菌检验取样计划应该依据风险评定结果制订，样品应该包含微生物污染风险最大产品。无菌检验样品取样最少应该符合以下要求：（一）无菌灌装产品样品必须包含最初、最终灌装产品以及灌装过程中发生较大偏差后产品；（二）最终灭菌产品应该从可能灭菌冷点处取样；（三）同一批产品经多个灭菌设备或同一灭菌设备分次灭菌，样品应该从各个/次灭菌设备中抽取。普通随机抽样，确保样品代表性和原始性，复试样品应尽可能重现原取样。第42页注意事

28、项只要供试品性状允许，应采取薄膜过滤法（首选）只要供试品性状允许（溶解性、抑菌性），应将全部容器内全部内容物过滤验证用供试品用最大量阳性对照分开培养大肠埃希菌代替铜绿假单胞菌（G+敏感，确保结果有效）无菌检测14天（赔偿生长条件、潜在低生长者、修复受损细胞）优先选取密闭式过滤器，或一次性过滤器滤膜材质（抗用低吸附），滤膜完整性，冲洗量。直接法接种供试品体积不得大于培养基体积10%，每管装量硫乙醇酸盐流体培养基不少于15ml，改良马丁培养基不少于10ml，可用浓缩培养基，或增加培养容器数。第43页结果判断阳性管生长良好，阴性管不得长菌，不然试验无效。以一次检出为准，不得复试。（低检出率，试验环境

29、、条件改进当符合以下最少一个条件时，方可判试验结果无效；无菌检验试验所用设备及环境微生物监控结果不符合无菌检验法要求。回顾无菌试验过程中，发觉有可能引发微生物污染原因。阴性对照管有菌生长。供试品管中生长微生物经判定后，确认是因无菌试验中所使用物品和（或）无菌操作技术不妥引发。第44页结果确保有效结果可靠结论培养基确保结果判断SOP操作人第45页方法验证普通程序与步骤需前处理不需前处理有抑菌作用样品无抑菌作用去除抑菌作用检验验证前处理方法对污染菌生长、检出影响。能够经过验证试验判断验证抑菌活性去除有效性，以及去除方法对污染菌生长、检出影响。第46页无菌检验验证试验：供试品直接接种法薄膜过滤法10

30、0ml/筒试验组（供试品+菌）金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠、枯草杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉培养基对照组阳性菌对照组（加菌同试验组）要求T培养35天观察结果书写验证汇报稀释剂对照组第47页微生物程度检验第48页微生物程度检验：口服、外用控制项目杂菌数：细菌数、霉菌和酵母菌数。控制菌（致病菌）：大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌、白色念珠菌。制订标准：非无菌药品微生物程度标准是基于药品给药路径及对患者潜在危害而制订。依据标准检验控制菌第49页不含药材原粉制剂含药材原粉制剂：丸剂含动物药制剂外用制剂滴眼剂普通局部用药直肠给药制剂尿道、阴道给药制剂滴鼻剂不一

31、样制剂程度第50页注意事项采取稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品抑菌活性供试液从制备到加入检验用培养基不得超出1小时供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超出45供试品须符合微生物程度标准和菌数汇报规则，应采取使微生物生长更高稀释级进行验证。（10-3，1000）无适当方法消除抑菌性检验方法，选择回收率更靠近要求方法和条件应对生产工艺和产品特征进行风险评定，确保检验结果准确性和产品质量。汇报规则（平均数，300cfu）培养温度、培养时间改变检验量（中药膜剂，沙门菌）样品稀释级选择（验证）离心法500转/分，3分钟（中药混悬剂重新验证，只适用细菌）控制菌-

32、培养基适用性（促生长能力、指标能力和抑制能力）参考培养基（比较菌落形态、大小、指标剂反应、生长速度）最长（抑）、最短（生）培养时间。疑似菌确认，选择认可菌种判定方法，阳性对照试验最少进行到分离步骤。第51页微生物程度检验法验证细菌、霉菌及酵母菌数计数方法验证定量回收率测定试验控制菌检验方法验证定性能否生长、专属性试验第52页回收率计算试验组菌回收率=（试验组平均菌落数-供试品组平均菌落数）/菌液组平均菌落数100%稀释级对照组菌回收率=（稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数）100%在3次独立平行试验中，稀释剂对照组、试验组回收率均不低于70%，若任一次试验中回收率低于70，应重新选择方法

33、再验证。第53页方法验证：控制菌控制菌：大肠埃希菌，铜绿假单胞菌、沙门菌、大肠菌群、生孢梭菌计数方法：平皿法、薄膜过滤法。特殊：生孢梭菌（加菌量：10100cfu，只要求生长不要求回收率制订标准：非无菌药品微生物程度标准是基于药品给药路径及对患者潜在危害而制订。依据标准检验控制菌第54页原料药/赋形剂量微生物检验微生物能否在原料或赋形剂中生长或存活？提供支持数据，无须做微生物程度检验和制订认可标准原料或赋形剂是否无菌？不需深入做微生物程度检验法或制订认可标准原料/赋形剂合成/工艺相关步骤本身是否会降低微生物按照协议后药典各论制订微生物程度认可标准按照协议后药典各论制订微生物程度认可标准逐批检验

34、微生物程度和指示菌抽批检验微生物程度和指示菌是否有科学证实降低步骤会造成原料/辅料中微生物量认可程度（未检出觉指示菌）？提供支持数据，无须做微生物程度检验和制订认可标准所监控微生物量/指示菌量是否都低于要求程度？是否是是是否是是第55页非无菌制剂微生物检验制剂中是否含防腐剂或本身是否有抗微生物能力？制订防腐剂认可标准和认证在低于或等于指定最小防腐剂浓度时是否有效，并证实制剂本身抗微生物能力逐批进行微生物程度试验按照协议后药典各论制订微生物程度认可标准无须做微生物程度检验和制订认可标准是否每批都符合微生物程度标准？提供支持数据，无须做微生物程度检验和制订认可标准是否是否是制剂是否为固体剂型？是否有科学证据证实制剂有抑制微生物生长特征？否否是第56页确保药品微生物检验结果可靠有效路径药品微生物试验环境微生物监测环境微生物监测环境细菌与药品细菌比较结论第57页药典无菌检验法主要增修订情况第58页序言部分1、新增要求：“预防污染办法不得影响供试品中微生物检出。”2、新增要求：“日常检验还需要对环境进行监控。”3、新增要求：“无菌检验人员必须具备微生物专