抗生素诱导的细胞感受态与肺炎链球菌的耐药性

1、抗生素诱导的细胞感受态与肺炎链球菌的耐药性【摘要】针对环境中的压力，细菌会采取不同的响应以维持自身的稳定。某些抗生素可以诱导肺炎链球菌转变为感受态细胞，进步细胞转化率，从而产生更适宜生存的耐药突变株。本文根据近年来有关感受态的研究，重点阐述肺炎链球菌中抗生素诱导的感受态与耐药性之间的关系。【关键词】肺炎链球菌；抗生素；感受态；转化；耐药性AntibitistressinduedpeteneandthedrugKEYRDSStreptuspneuniae;Antibitis;petene;Transfratin;Resistane1经典理论中细菌耐药性和抗生素压力青霉素的发现和使用，开启了抗菌治

2、疗史上伟大的篇章。抗生素对于人类的安康事业功不可没，但短短几十年过后RSA、VRE及其它耐药菌的相继出现，使这些曾经风光的抗生素陷入了两难的境地。关于耐药菌的出现，经典理论认为，自然界中存在固有的耐药菌和耐药基因，它们通过质粒传递或转座子转移等基因交流的方式，将耐药基因传递给一些致病菌，从而产生了难以控制的超级耐药致病菌如RSA和VRE等1。对于耐药菌而言，抗生素起到了一种挑选的作用：将药物敏感性细菌杀死，为耐药菌的生存排除了竞争的阻力，有利于耐药菌群的生存和繁殖。抗生素在临床治疗中的广泛和长期使用，不可防止地导致耐药菌的出现，给抗菌治疗带来了许多困难。另外，抗生素作为促生长剂被添加到动物饲料

3、中，也是耐药菌出现的诱因之一。这些用于饲料的抗生素大多数可以人畜共用，长期使用后挑选出的耐药菌在人畜间传递很容易导致多种抗生素失效1。如今的临床研究发现，耐药菌出现频率越来越高，耐药程度越来越严重，假如仅仅归咎于抗生素挑选出的固有耐药菌，恐怕难以圆满的解答。抗生素同紫外线、离子射线、重金属和化学诱变剂一样，是一种环境压力，对细菌的生存造成一定程度的威胁，甚至通过对菌体的损伤导致其死亡2。而细菌无处不在，充分说明了这一种群在各种恶劣环境中强大的生存才能和适应性。在遭受到环境压力时，细菌会采取不同的应急策略来躲避风险、修复损伤，甚至改变自身的构造来适应各种环境的变化，如UV照射下大肠埃希菌的SS反

4、响，高温环境下的热休克反响和芽孢的形成等等，这些都是细菌针对某种特定压力的响应。有研究说明，当有抗生素作用时，细菌并不是平静地面对死亡，它们中的一些亚群也会产生某些对于抗生素压力的响应，如丝裂霉素和喹喏酮在大肠埃希菌中诱发出的SS反响。SS反响是细胞的一种易错修复机制，通过进步突变率降低菌体的死亡率3，4。但SS反响并不是细菌中普遍存在的规律性反响，自然界仍存在许多非SS型细菌，它们因为缺乏SS反响体系，不能通过可诱导的修复来到达适应环境的目的，因此必须通过其它途径加以补救。肺炎链球菌就是一种非SS型细菌，在其菌体中没有检测到SS反响相关的作用因子5。有实验证明，肺炎链球菌中可诱导的感受态反响

5、可作为一种SS反响的替代，通过转化作用最终产生更适宜生存的突变菌株2。2抗生素诱导的肺炎链球菌感受态2.1感受态和感受态调节系统转化，是一种基因交换的程序性机制，最早在肺炎链球菌中发现，现已证明存在于大多数细菌中。具有转化才能的细菌在其生长的某一阶段可以自然形成感受态，在此状态下的细胞具有吸附、吸收外源裸露DNA片段的才能。可以产生感受态的细菌中普遍存在着一组受调节子严密调控的感受态基因，在感受态刺激因子(petenestiulatingpeptide，SP)的作用下开启基因的表达，用于完成吸收并重组外源DNA的生命活动68。由于肺炎链球菌对感受态刺激因子的作用反响迅速且高度同步，因此是研究感

6、受态非常理想的模型9，10。肺炎链球菌中感受态基因的数量从最初发现的47个增加到1249或10510个(不同的文献报道)，几乎所有的基因都被组织在相邻的基因簇中，被调节子共同调控。它们按照功能和表达时间的先后，被划分为早期感受态基因和晚期感受态基因。早期基因主要对感受态的形成起调节作用，并进一步促使晚期感受态基因的表达；晚期感受态基因主要负责细胞对外源DNA的吸附、吸收和重组7。D/E是一个二因素调节单位，受SP的调控。D的基因产物为SP的受体，是一种跨膜蛋白，含有7个跨膜的螺旋。D具有组氨酸激酶的活性，与相应的SP结合后可磷酸化激活E蛋白。E蛋白为一转录因子，被激活后产生多重效应：一是与操纵

7、子/D/E的启动子结合促进这三个基因的表达，形成自身诱导的正反响效应；二是可激活具有因子活性的X蛋白，而X同RNA聚合酶形成复合物，启动感受态晚期基因的表达。基因被认为是一种感受态所必需的依赖E的调节子，它通过阻止lpP依赖的蛋白水解酶对X的水解作用来稳定X蛋白同RNA聚合酶的复合物，同时通过一些尚未明晰的机制来活化此复合物，使晚期基因的表达更加严密地被E传导的信号所调控14，15(图1)。在调节子控制的22个转化必需基因中，剩余的14个基因属于晚期基因，它们编码的蛋白质用于DNA的吸收(l，EA/，FA/，GA/B/D/G)和处理单链DNA(iA，dprA，reA和ssbB)11。至少有70

8、个基因对转化是非必需的，但由于感受态基因具有很多的重叠，因此它们不能被去除，并同时具备一些基因重叠后才有的功能9。这些“多余的基因和功能说明调节子的作用不仅仅是诱导细胞形成感受态，还可能有着其它的作用。有研究者认为“感受态已经缺乏以描绘肺炎链球菌中X所决定的生理状态，因此开场倾向于使用一个中性化而不带任何功能的词语“X态(Xstate)来描绘这一生理状态16。2.2抗生素诱导的细菌感受态比照丝裂霉素在大肠埃希菌中诱发出SS反响17，研究者在肺炎链球菌中进展了相关试验，使用了一个可转录的交融基因ssbB:lu，即一个Phtinus肺炎链球菌感受态调控系统pyralis内的可以编码荧光素的报告基因

9、lu和感受态晚期基因组中的ssbB的交融体18。ssbB基因是感受态晚期基因组中的一个代表，同时在SS相关基因中也存在，它可以编码单链DNA结合蛋白SsbB，在基因重组中起到不可或缺的作用。参加一定浓度的丝裂霉素后，观察到交融基因表达程度上升，提示丝裂霉素可以诱导肺炎链球菌中重组相关基因ssbB的表达。对照实验中采用一株基因缺陷菌株，在参加丝裂霉素后交融体不被表达3，这说明丝裂霉素诱导重组相关基因ssbB的表达，需要在细胞具有完好的基因的前提下进展，即细胞需要通过诱发感受态来开启同源重组的生理活动。以上试验证明某些抗生素如丝裂霉素可以诱导肺炎链球菌中基因的表达，使正常细胞转变为感受态细胞，促进

10、细胞内部的转化作用。除了丝裂霉素，氟喹诺酮类抗生素在肺炎链球菌中也能诱发感受态基因的表达2，19。丝裂霉素通过阻碍复制叉的前进而影响染色体的复制；喹诺酮类抗生素(氟哌酸，左氧氟沙星和莫西沙星)的作用靶点是DNA解旋酶(拓扑异构酶II)，通过使拓扑异构酶与DNA发生共价交联阻止DNA的复制19，20。由此可见，这两类抗生素的作用机制都是阻碍细菌染色体的复制，当它们作为细菌生存环境中的压力时可能传递着一样的信号，即在肺炎链球菌中可以诱发出一样的响应感受态。3肺炎链球菌感受态与耐药突变在肺炎链球菌中多种抗生素可以诱导细胞转变为感受态，这种转变为遗传转化做好了生理上的准备。为了证明抗生素诱导的感受态细

11、胞可以有效率地进展遗传转化，研究者设计了一个试验：将携带链霉素耐受基因的DNA片段参加到肺炎链球菌培养物中，同时参加一定剂量(625ng/l)的链霉素，并用无链霉素添加的培养物作为对照。链霉素必须适量，防止导致菌体大规模死亡。结果显示，在链霉素处理过的培养物中出现了耐受，而对照实验中那么没有出现耐受，因此可以确定链霉素诱发的感受态细胞可以有效吸收外源DNA用于同源重组。假如再参加一定量的SP(100ng/l)并不会进一步进步肺炎链球菌的转化率，即抗生素可以通过诱发感受态进步菌体的转化效率，且这种诱发作用不依赖于SP的含量3。同样条件用丝裂霉素或诺氟沙星交换链霉素重复此试验，可以观察到同样的现象

12、。当抗生素诱导细胞出现感受态后，细胞就能有效率地吸收适宜的外源DNA片段，这为耐药突变的出现提供了先决条件。但在肺炎链球菌群落中，如何有效率地获取足够并且适宜的外源DNA用于遗传转化是研究人员关注的另一个问题。针对肺炎链球菌的研究说明，同一个群落里的细菌可以按照不同表型分为假设干个亚群。就可否诱导出感受态而言，分为感受态型细胞和非感受态型细胞21，22，这些不同亚群的细胞在遗传背景上存在着某些差异。如今有研究者认为，正是这些不同亚群的细胞，为遗传转化提供了丰富的基因资源。在抗生素的作用下，一个细菌亚群被诱发成为感受态细胞，而另一个细胞亚群那么被药物杀死，后者为前者提供了充足的基因资源23。现已

13、在多个肺炎链球菌感受态诱发模型中观察到非感受态细胞亚群被溶解的现象，即异体胞溶(fratriide/sbriniide)现象21。这些被溶解的细胞可能是一些因突变而丧失转化才能的细胞，或是一些仍具有转化才能但却有着不同表型的细胞。异体胞溶现象已被证实有一定生物学意义，是一种战胜其它竞争者以获得生存优势的策略。异体胞溶是感受态亚群采取的一种侵略性反响，通过杀死其它亚群的细胞来获取溶菌后的营养物质，如DNA和氨基酸24。同时，感受态细胞也会释放毒力因子和过敏介质来诱发感染，通过活化宿主体内的防御组织来稳定与宿主间的联络，获得暂时的生存优势。异体胞溶和遗传转化的协同作用可能暗示着两者的组合作用会给环

14、境压力下的细菌带来更多的生存优势。感受态相关基因的研究证实，四个晚期基因(bpD，lytA，ibA和ibB)的产物与遗传转化作用无关，它们很可能在异体胞溶中起作用22，24，25。这些基因被SP所诱导，分别编码胞壁质水解酶(一种主要的自溶物质)和一种二肽细菌素。胞溶过程涉及到第三种溶菌酶Lyt的作用，这种物质并不为SP诱导的基因所编码。同时，有两种免疫因子被证明用来保护感受态细胞免受裂解24。同比枯草芽孢杆菌感受态的研究发现，枯草芽孢杆菌在诱发感受态的同时会启动细胞内消费外表活性剂的反响，这可能也是为了溶解其它细胞，释放其中的DNA和氨基酸以备后续的遗传转化26。4总结和展望当细菌面临环境压力

15、时，会采取不同的方式来应对，即针对压力的响应，如当用丝裂霉素作用于大肠埃希菌时可以诱发SS反响。但并不是每一种细菌中都存在SS反响，一些非SS型细菌如肺炎链球菌在面临生存压力时必须采取其它的响应方式，以保证自身的生长繁殖。现有研究说明肺炎链球菌中感受态可作为SS反响的替代。抗生素作为一种环境压力，可以在肺炎链球菌中诱发出感受态，为后续的遗传转化做好生理上的准备，并且也能通过诱发异体胞溶作用提供适宜的外源DNA片段，为遗传转化做好物质上的准备。感受态在整体上是被严密控制的，通过在一些最有代表性的物种内研究感受态的调节机制，可以理解这一过程是如何同细胞的整体调节网络联络起来的。尽管对菌体诱发感受态的机制理解得尚不够确切，但是这里所有的数据都可以说明诱发感受态的一个主要目的是通过转化来实现整体的遗传多样化。感受态的诱导对于一些像肺炎链球菌这样的非SS型菌种来说是非常重要的，因为这可能是这些菌株实现遗传多样化的唯一途径。然而感受态的研究过程中还存在着许多未能解释清楚的问题，如感受态相关基因中看似“多余的基因在压力响应的过程中起到了怎样的作用？是否可以诱导感受态的菌