DB12-T651-2016转基因耐除草剂大豆GTS40-3-2及其衍生品种定量检测实时荧光PCR方法

1、ICS 67.050B23DB12天 津 市 地 方 标 准DB12/T 6512016转基因耐除草剂大豆GTS40-3-2及其衍生品种定量检测实时荧光PCR方法Detection of genetically modified plants and derived productsQuanlitative PCR method for herbicide-resistant soybean GTS 40-3-2 and its derivates2016-11-01 实施2016-09-27 发布天津市市场和质量监督管理委员会发布DB12/T 6512016I本标准按照GB/T 1.1-20

2、09给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出o本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、中国农业科学院生物技术研究所、天 津市质量技术监督宝堆检测中心。本标准主要起草人：兰青阔、宛煜嵩、杨炳存、赵新、李亮、陈锐、朱珠、刘娜、王成、徐石勇。 本标准2016年9月首次发布。DB12/T 6512016 转基因耐除草剂大豆GTS40-3-2及其衍生品种定量检测实时荧光PCR方法1范围本标准规定了转基因耐除草剂大豆GTS 40-3-2转化体特异性定量PCR检测方法的术语和定义、 检测方法、结果计算。本标准适用于转基因耐除草剂大豆GTS 40-3-2及其衍生品种，以及制品中GTS 40

3、-3-2转化体的 定量PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T 672转基因植物及其产品检测通用要求农业部1485号公告一42010转基因植物及其产品成分检测 DNA提取和纯化农业部2031号公告一192013转基因植物及其产品检测抽样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1Lectin 基因 Lectin gene编码大豆凝集素的基因。3. 2GTS 40-3-2 转化体特异性序列 ev

4、ent-specific sequence of GTS 40-3-2GTS 40-3-2外源插入片段5,端与大豆基因组的连接区序列，包括35S启动子部分序列和大豆基因 组的部分序列。4原理根据大豆外源基因和内标基因特异性序列设计引物和TaqMan荧光探针，对标准样品和试样同时 进行实时荧光PCR扩增。根据标准样品模板拷贝数与Ct值间的线性关系，分别绘制外源基因和内标 基因的标准曲线。计算试样中外源基因和内标基因的拷贝数及其比值。5检测方法5. 1试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馅水或符合GB/T 6682规定的一级水。5. 1. 1 TaqMan荧光PCR反应试剂盒。5.1.2

5、引物和探针。5. 1.2. 1 Lectin 基因。lec-1215F： 5，-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3lec-1332R： 5，-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3lec-1269P： 5，-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-3预期扩增片段大小为118 bp （参见附录A）。5. 1.2.2 GTS40-3-2转化体特异性序列。GTS40-3-2F： 5- CCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGG - 3GTS40-3-2R： 5- GACTTGTCGCCGGGAATG - 3GTS40-3-2P： 5 -CGCAACCGCCCGCAA

6、ATCC- 3预期扩增片段大小为121 bp （参见附录A）。用水分别将上述引物和探针稀释到10 gmol/L,探针 需避光保存。5.2仪器分析天平：感量0.1 g和0.Img；荧光定量PCR扩增仪；核酸定量仪；重蒸馅水发生器或纯水仪； 其他相关仪器设备。5. 3分析步骤5.3.1抽样按NY/T 672和农业部2031号公告192013规定执行。5. 3. 2试样准备按NY/T 672和农业部2031号公告192013规定执行。5.3.3试样预处理按农业部1485号公告42010规定执行。5.3.4 DNA模板制备按农业部1485号公告42010规定执行。5.3.5标准曲线样品制备采用相同的标

7、准样品绘制GTS40-3-2转化体和Lectin内标基因的标准曲线。提取GTS40-3-2标 准物质基因组DNA,用O.lxTE或水稀释至1x105-5x105 copies/gL （相当于20-100 ng/gL）,作为初始 模板。然后再用O.lxTE梯度稀释初始模板，制备不同浓度的GTS40-3-2标准溶液。标准溶液至少涵 盖5个GTS40-3-2浓度梯度，最低浓度拷贝数小于200,最高浓度拷贝数大于400005. 3. 6 PCR 反应5. 3.6.1标准样品和试样实时荧光PCR反应同时进行标准样品和试样的PCR反应，每个PCR反应设置3次平行。GTS40-3-2转化体实时荧 光PCR反

8、应按表1在PCR反应管中依次加入反应试剂，混匀；Lectin内标基因实时荧光PCR反应按DB12/T 6512016 表2在PCR反应管中依次加入反应试剂，混匀。将PCR管放在离心机上，500 g3 000 g离心10 s, 然后取出PCR管，放入PCR仪中。运行实时荧光PCR反应。反应程序为：95C变性2 min；进行45 次循环扩增反应(95C变性15 s, 60C退火延伸1 min)；在第二阶段的退火延伸(60 C)时段收集荧 光信号。表1 GTS40-3-2 PCR反应体系试剂终浓度体积TaqMan反应缓冲液IX一10 卩mol/L GTS40-3-2F0.8 卩mol/L2.0 卩L

9、10 卩mol/L GTS40-3-2R0.8 卩mol/L2.0 卩L10 卩mol/L GTS40-3-2P0.4 卩mol/L1 .0 卩LDNA模板2.0 卩L无菌水一总体积25.0 卩L根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。“一”表示体积不确定。根据TaqMan反应液的浓度确定其体积，并相应调整 水的体积，使反应体系总体积达到25.0 |1L表2 Lectin内标基因PCR反应体系试剂终浓度体积TaqMan反应缓冲液IX一10 卩mol/L lec-1215F0.2 卩mol/L0.5 卩L10 卩mol/L lec-1332R0.2 卩mol/L0.5 卩L10 卩mol/L le

10、c-1269P0.2 卩mol/L0.5 卩LDNA模板2 .0 卩L无菌水一总体积25.0 卩L根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。“一”表示体积不确定。根据TaqMan反应液的浓度确定其体积，并相应调整 水的体积，使反应体系总体积达到25.0 |1L5. 3.6. 2设置对照应设置阴性对照和空白对照。以非转基因大豆材料提取的DNA作为GTS40-3-2转化体特异性检 测的阴性对照的模板；以進圭鱼精子DNA作为Lectin内标基因检测的阴性对照的模板；用纯水作为空 白对照PCR反应体系的模板。各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与5.3.6.1.4 相同。5.3.7数据

11、分析5. 3. 7.1设定阈值实时荧光PCR反应结束后，以PCR刚好进入指数期扩增来设置荧光信号阈值，并根据仪器噪声 情况进行调整。设定阈值处，要求不同浓度梯度标准品的扩增曲线平行，而且同一样品的不同平行间 重复性良好。5. 3. 7.2记录Ct值 DB12/T 6512016设定阈值后，荧光定量PCR仪的数据分析软件自动计算每个反应的Ct值，并记录。5. 3. 7. 3绘制标准曲线根据标准溶液的扩增Ct值和初始模板拷贝数的对数间的线性关系，分别绘制GTS40-3-2转化体和 Lectin内标基因的标准曲线。标准曲线公式：y = ax + b(1式中：y一测试样品的Ct值； a标准曲线的斜率；

12、 x一模板拷贝数以10为底数的对数； b一标准曲线的截距。5. 3. 7. 4数据可接受的标准GTS40-3-2阴性对照和空白对照的GTS40-3-2转化体Ct值N38； Lectin阴性对照和空白对照的 Zee沥内标基因Ct值N38；标准曲线的R20.98,标准曲线斜率N -3.6且W -3.1；满足上述条件，可 以进行结果计算。否则重新进行实时荧光PCR扩增。5. 3. 7. 5含量计算5.3.7.5.1计算试样模板拷贝数将试样的GTS40-3-2转化体和Lectin内标基因的Ct值分别带入GTS40-3-2转化体和Lectin内标 基因的标准曲线方程，计算GTS40-3-2转化体和大豆内

13、标准基因Lectin的拷贝数。计算试样模板拷贝数公式：y-b=10(2)式中：n一模板拷贝数y一测试样品的Ct值； a标准曲线的斜率； b一标准曲线的截距。5.3.7.5.2计算试样中转基因含量将GTS40-3-2转化体拷贝数和Lectin内标基因拷贝数带入公式(3),计算出试样中GTS40-3-2百 分含量。计算试样中GTS40-3-2转化体百分含量的公式：c(%)=*Axioo %(3)Lectin式中：C一试样中GTS40-3-2的百分含量(%)； nGTS40-3-2 GTS40-3-2 转化体拷贝数； 也如一大豆内标准基因Lectin拷贝数。DB12/T 6512016 6结果分析与

14、表述Lectin内标基因和GTS40-3-2转化体均出现典型扩增曲线，且Lectin内标基因和GTS40-3-2转化体 的。值36,表明样品中检出耐除草剂大豆GTS40-3-2转化体。表述为“样品中检测出GTS40-3-2转 化体，GTS40-3-2转化体含量为c”。Lectin内标基因出现典型扩增曲线，且Ct值36, GTS40-3-2转化体。值238或未出现典型扩增 曲线，表明样品中未检出耐除草剂大豆GTS40-3-2转化体。表述为“样品中未检测出GTS40-3-2转化 体Lectin内标基因和GTS40-3-2转化体出现典型扩增曲线，Lectin内标基因。值36, GTS40-3-2转

15、化体Ct值在3638之间，应进行重复实验。如重复实验结果符合6.1-6.2的情况，依照6.1-6.2进行 判断；如重复实验GTS40-3-2转化体出现典型扩增曲线，但。值仍在3638之间，则判定样品检出 GTS40-3-2转化体，表述为“样品中检测出GTS40-3-2转化体”。6.4Lectin内标基因和GTS40-3-2转化体未出现典型扩增曲线，或。值238,表明样品中未检出大豆。 表述为“样品中未检测出大豆成分”。6.5 Lectin内标基因和GTS40-3-2转化体出现典型扩增曲线，但。值均在3638之间，应进行重复实 验。如重复实验结果符合6.1-6.4的情况，依照6.1-6.4进行判

16、断；如重复实验Lectin内标基因和 GTS40-3-2转化体出现典型扩增曲线，但。值仍在3638之间，则判定样品检出GTS40-3-2转化体, 表述为“样品中检测出GTS40-3-2转化体附录A(资料性附录)A.l Lectin基因实时荧光PCR扩增产物核昔酸序列(Accession No.K00821)1 GCCCTCTACT CCACCCCCAT CCACATTTGG GACAAAGAAA CCGGTAGCGT TGCC|AGCTTC61 |gccgcttcct tcaacttcac| cttctatgcc cctgacacaa aaaggcttgc agatgggc 注：划线部分为lec-1215F和lec-1332R引物序列，方框内为探针lec-1269P序列。