檀香萜烯合成酶基因的克隆与序列分析

1、檀喷鼻萜烯分解酶基果的克隆与序列阐收文海涛，赵黑英，林励，邱贤秀【关键词】檀喷鼻;萜烯分解酶;基果克隆;序列阐收Keyrds:SantalualbuL.;terpenesynthase;genelning;sequeneanalysis贵重中药檀喷鼻为檀喷鼻科动物檀喷鼻(SantalualbuL.)的树干心材，为止气温中、开胃止痛之经常使用中药1。檀喷鼻本产于印度、印度僧西亚等天，1962工夫北动物园从印僧引种檀喷鼻并正在广东天域试种成功2。檀喷鼻正在自然死少情况下需10年左右才华初步构成具有芬芳气息的心材(雅称结喷鼻)，30年以上才华供药用，檀喷鼻心材挥收油是其主要活性成分，已有研讨说明檀喷

2、鼻挥收油主要成分为萜烯类化开物，其中檀喷鼻醇等倍半萜烯类占挥收油总量的60%80%3。如今国内外对檀喷鼻研讨的报导主要会集于檀喷鼻栽种妙技战檀喷鼻挥收油组分阐收上4，而对檀喷鼻心材挥收油储蓄积累机理却陈睹报导。鉴于此，本研讨拟对参与檀喷鼻萜烯类化开物死物分解过程中的关键酶萜烯分解酶基果举止克隆战阐收。萜类物量的前体同戊烯基焦磷酸正在萜烯分解酶的做用下构成不同的萜类骨架，经过不同建饰酶的做用后构成不同的萜类化开物，该酶基果的克隆将为阐收檀喷鼻挥收油储蓄积累的机理供应实际支撑，同时也为利用基果工程本领培育檀喷鼻良种、膨胀檀喷鼻死终年限和前进檀喷鼻挥收油露量等圆里研讨奠定稳固的基矗1材料与要收1.1

3、材料战试剂1.2要收参照hang等5要收举止提与并稍减改进。改进的地方为用三氯甲烷/同戊醇(241)抽提两次、用10lL-1Lil沉淀过夜，其他不变。采与Takara公司PrieSriptT1stStrandDNASynthesisKit反转录RNA成DNA。步伐为：(1)正在离心管中顺次参与总RNA4L，lig(DT)1L，dNTP(10lL-1)1L，减RNasefreeater至整体积10L;(2)65连结5in，火速与出冰上摆设3in;(3)按顺次分别参与5Buffer4L，RNaseinhibitr0.5L，RNasefreeater4.5L，PrieSriptRTase1L，42保

4、温1h，70灭活15in。于-20保存备用。PR扩删前提：94，4in;94，50s，59，50s，72，2in;34轮回;72，10in。2结果与阐收2.1檀喷鼻心材总RNA提与采与TAB提嫁Lil沉淀法提与的檀喷鼻心材总RNA，经1.0%甲醛变性凝胶电泳后，结果如图1所示。从图1可以看出，提与的檀喷鼻心材总RNA其28S战18S条带较清楚，稍有降解。用核酸卵黑仪测定RNA的量量，结果其A260/A280值均正在1.62.0之间，A260/A230的值正在2.02.3之间，分析此要收提与的RNA量量较好，可以用于后绝真止。2.2檀喷鼻萜烯分解酶基果克隆2.3檀喷鼻萜烯分解酶基果序列阐收将经初

5、步断定的阳性克隆支英潍捷基公司测序，经由过程序列拼接后获得齐少为1812bp的序列，露有1731bp编码区，编码576个氨基酸残基，重命名为TPS1。利用NBI中的BLASTn举止序列比对，创造该序列与已正在GenBank登录的一个一样去自于檀喷鼻(黑檀)的单萜分解酶基果序列(EU798692)同源性为99%，正在部分1731个碱基中只要6个存正在不同。两个序列编码的氨基酸序列比对后创造，其同源性一样为99%，氨基酸残基正在4个位面上存正在不同，分别是53位S/T、529位H/Y、439位T/I战515位D/G，此外两个氨基酸序列皆具有动物萜烯分解酶家眷的保守天域。果而初步揣度本研讨获得的基因为檀喷鼻萜烯分解酶基果。3会商本研讨获得了一个