免疫共沉淀专题知识讲座

1、免疫共沉淀技术第1页免疫沉淀（IP）免疫共沉淀（CO-IP）免疫共沉淀结果分析第2页 免疫沉淀（immunoprecipitation IP）是利用抗体特异性反应纯化富集目标蛋白一个方法。利用抗体可与抗原特异性结合特征，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来。一、免疫沉淀（IP）定义第3页一、免疫沉淀（IP）原理 免疫沉淀（immunoprecipitation IP）是利用抗原蛋白质和抗体特异性结合以及细菌蛋白质“protein A/G特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)FC 片段现象开发出来方法。当前多用protein A/G 预先结合在argarose beads 上，使之与含有抗原溶液及抗

2、体反应后，beads 上prorein A/G 就能到达吸附抗原目标。经过低速离心，能够从含有目标抗原溶液中将目标抗原与其它抗原分离。第4页一、免疫沉淀（IP）原理第5页一、免疫沉淀（IP）步骤 抗体与细胞裂解液或上清中对应蛋白结合后，再与蛋白A/G（ProteinA/G），经过离心得到珠子-蛋白A/G-抗体-目标蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂作用下，抗原与抗体解离，离心搜集上清，上清中包含抗体、目标蛋白和少许杂蛋白，再进行SDS，Western blotting 或质谱分析，即样品处理（温度，裂解液成份）；抗体-agarose beads

3、孵育（选择适当阴性对照）；抗体-agarose beads复合物洗涤；判定第6页第7页一、免疫沉淀（IP）要求非变性条件下进行试验；需要高质量抗体；免疫沉淀体系需要有严格控制指标第8页基于最基本免疫沉淀试验衍生出了许多免疫沉淀相关试验伎俩：免疫共沉淀；染色质免疫沉淀；RNA-蛋白免疫沉淀第9页 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）是以抗体和抗原之间专一性作用为基础用于研究蛋白质相互作用经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用有效方法。二、免疫共沉淀（CO-IP）定义第10页 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在许多蛋白质蛋白质间相互作用被保

4、留了下来。假如用蛋白质x抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合蛋白质y也能沉淀下来。这种方法惯用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一个特定蛋白质新作用搭档。二、免疫共沉淀（CO-IP）原理第11页二、免疫共沉淀（CO-IP）原理第12页（1） 蛋白样品准备：假如为细胞样品，需先裂解细胞；（2） 抗原抗体结合反应；（3） Protein A/G 与抗原抗体复合物结合；（4） 免疫复合物与 protein A/G 解离： 普通采取 2% SDS 煮沸 5 分钟处理样品；（5） 分析判定：应用 SDS，western-blotting 或质谱仪分析判定样品二、免疫共沉淀（CO-IP）试验流

5、程第13页蛋白A ， 蛋白B 抗A抗体C进行洗脱抗B抗体D进行验证？二、免疫共沉淀（CO-IP）与IP比较IP C ACO-IP C A+B D第14页相互作用蛋白质都是经翻译后修饰，处于天然状态；蛋白相互作用是在自然状态下进行，能够防止人为影响；能够分离得到天然状态相互作用蛋白复合物。二、免疫共沉淀（CO-IP）优点第15页可能检测不到低亲和力和瞬间蛋白质蛋白质相互作用；两种蛋白质结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用； 如用western blot检验，必须在试验前预测目标蛋白是什么，以选择最终检测抗体，若预测不正确，试验就得不到结果，试验本身含有冒险性。二、免疫共沉淀（CO

6、-IP）缺点第16页1. 试验最需要注意点就是抗体性质。抗体不一样和抗原结合能力也不一样，免染能结合未必能用在IP反应。提议仔细检验抗体说明书。尤其是多抗特异性是问题。2. 为预防蛋白分解，修饰，溶解抗原缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行试验。3. 考虑抗体/缓冲液百分比。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残余在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。二、免疫共沉淀（CO-IP）注意第17页在免疫共沉淀试验中确保试验结果真实性？ (1) 确保共沉淀蛋白是由所加入抗体沉淀得到，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体使用有利于防止污染发生；(2) 要确保抗体特异性，即在不表示抗原细胞溶解物中添加抗体后不会引发共沉淀；(3) 确定蛋白间相互作用是发生在细胞中，而不是因为细胞溶解才发生，这需要进行蛋白质定位来确定。第18页三、免疫共沉淀结果分析IRF-3与TRAM有互作；TRAM与IRF-3有互作；CBP与TRAM有互作。