人脱细胞羊膜负载大鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程膀胱的研究

1、人脱细胞羊膜负载大鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程膀胱的研究【摘要】目的讨论人脱细胞羊膜Huanaellularanitiebrane，HAA负载大鼠骨髓间充质干细胞(Ss)进展膀胱替代修复的可能性。方法用去污剂洗涤和酶消化方法制备HAA。将大鼠Ss在体外培养、扩增、传代。取第4代干细胞用1%二甲亚砜DS预诱导8h，然后应用膀胱匀浆上清液诱导7d。将诱导分化后的Ss接种于HAA外表进展短暂体外培养，获得组织工程膀胱。将雄性大鼠60只随机分为3组，行半膀胱切除术，然后分别采用负载干细胞后的HAAA组、HAAB组以及单纯缝合组的方法进展修补，每组20只。分别于术后2、4、8测定膀胱容量、进展膀胱造影

2、并取材观察组织再生情况。结果去污剂洗涤结合酶消化法能有效去除人羊膜中的细胞成分，光镜及电镜观察无细胞成分残留，细胞相容性好。大鼠膀胱重建术后，A、B两组与组膀胱最大容量(Vlax)比拟有极显著性差异P0.01，而A、B两组之间膀胱最大容量比拟无显著性差异P0.05。组织学观察，2时HAA即已吸收降解，膀胱移行细胞和平滑肌细胞开场形成，A组吻合修补区较厚，平滑肌细胞规那么且丰富。结论HAA作为膀胱移植物进展膀胱修补吸收降解迅速，负载Ss后构建的组织工程膀胱是理想的替代修补材料。【关键词】膀胱；移植；脱细胞羊膜；生物医学工程最早应用组织工程学原理进展组织工程膀胱构建的是akefrest大学医学院再

3、生医学研究所的Atala等人，他们于1998年进展了同种异体狗再造膀胱的实验研究1。目前组织工程学技术的研究主要集中在二个方面：支架材料的研究与开发；种子细胞的培养和植入受损的组织，使其功能得到恢复。膀胱无细胞基质和小肠黏膜下层是目前报道最多的组织工程膀胱支架材料。羊膜是一种天然高分子生物材料，来源广泛，不违犯伦理。本研究采用化学去污剂和酶消化的方法去除新颖羊膜中的细胞成分，保存细胞外基质，制备人脱细胞羊膜HAA作为支架材料，并以大鼠骨髓间充质干细胞(Ss)为种子细胞构建了组织工程膀胱，讨论异种来源的HAA作为生物支架材料构建组织工程膀胱的可行性。1材料与方法1.1实验材料1.2种子细胞培养1

4、.2.1SD大鼠Ss的别离与原代培养21.2.2大鼠膀胱匀浆上清液对Ss的诱导分化8周龄大鼠4只，无菌取其膀胱，立即用PBS液冲洗，匀浆、离心，取上清液用0.2的针头滤器过滤。取第4代Ss以2104/l密度接种于预置盖玻片的6孔培养板中培养2d，使细胞贴壁。吸出培养基，换入含有1%DS的培养基预诱导8h，然后换入膀胱匀浆上清液与DE为11的混合培养基培养7d。期间换液1次。1.2.3培养细胞免疫细胞化学染色鉴定及纯度计算1.3HAA制备1.3.1羊膜的选材1.3.2HAA细胞毒性测定按照文献3要求制备HAA浸提液；取诱导分化的Ss按1104细胞/孔接种于96孔板，正常培养基组为对照组，浸提液组

5、为实验组；TT法测定吸光度A值，计算细胞相对增殖率RGR,RGR实验组A值/对照组A值，并对材料毒性评分4。1.4组织工程膀胱的构建1.4.1Ss接种诱导分化后的Ss以2104/l密度接种于预置22HAA的6孔培养板中后加培养基2l。置37、5%2培养箱内，在饱和湿度条件下复合培养。1.4.2Ss/HAA复合物显微镜检查收获培养36h的Ss/HAA复合物，HE染色光镜及扫描电镜检查。转贴于论文联盟.ll.1.5大鼠膀胱修复重建实验1.5.1大鼠膀胱重建1.5.2术后膀胱检测分别于术后2、4、8时，每组取5只动物处死。处死前测定膀胱最大容积(Vlax)。方法是将膀胱排空，用注射器经细尿管婴幼儿输

6、液器向膀胱注入生理盐水，尿道外口有尿液滴出时注入的水量即为Vlax。解剖观察膀胱大体形态，并根据标记线取材固定，HE染色后光镜下观察组织学变化。第8周时各组动物进展膀胱造影后再进展前述处理。1.6统计学方法数据采用xs表示,组间比拟采用t检验。2结果2.1种子细胞培养2.2HAA检测将经物理和酶处理的HAA做HE染色，置光学显微镜下观察，可见大量浅红色胶原纤维未受损，无蓝染核物质，外表没有残留的细胞碎屑。扫描电镜下HAA外表粗糙，一面为网状纤维构造，孔隙较多，大小不一。两面均无细胞残留(图1)。HAA浸提液组细胞平均相对增殖率为88%，毒性评分为级表1，证明所制备的HAA组织相容性好，符合生物

7、材料应用要求。表1细胞相对增殖率和细胞毒性分级(略)2.3组织工程膀胱构建复合培养36h后HE染色观察可见HAA材料上生长的细胞，部分融入支架材料内；扫描电镜下可见Ss生长良好，且有突起伸出固定于周围支架材料图1。2.4大鼠重建膀胱的大体观察及容量测定A、B、三组术后1内分别死亡5只、4只和1只，均死于尿外渗和膀胱周围感染。另外A、B两组均有一只动物有明显尿外渗腹腔肿大，但未死亡，后尿外渗逐渐好转。术后2时重建膀胱被大网膜包绕，仔细别离后可见标记线内膀胱已愈合良好，但较薄，不能识别出HAA。4、8时仍可见部分黏连，A、B两组膀胱已达正常膀胱外观，组膀胱明显缩小，部分黏连比A、B两组细微。2时A

8、组大鼠膀胱的Vlax为(1.210.60)l，B组为(1.120.53)l，两组比拟无统计学意义P0.05，组(0.750.41)l,与A、B两组比拟均有显著差异(P0.05)。随时间延长，4、8时大鼠的膀胱容量略有增加但两组仍无差异。8时膀胱造影见A、B两组重建的膀胱与正常膀胱相似，组膀胱明显缩小表2、图2。2.5重建膀胱的组织学观察A组和B组术后2时HAA修复区已有上皮细胞和膀胱平滑肌细胞形成，但B组平滑肌和上皮层较薄，平滑肌不规那么，A组那么上皮层和平滑肌略厚，相对规那么。两组均有嗜酸细胞和淋巴细胞等炎性细胞浸润图3；4和8时两组已经与正常膀胱组织无明显区别。组2时切口区仅细微炎性细胞浸

9、润，无其他异常。表2手术各组术后不同时间Vlax的测定结果略3讨论组织工程学是近年来新兴起的一门学科，受到了科学界的广泛关注。其核心是利用组织工程学技术与生命科学的成果，将活细胞与生物材料结合，修复、重建、维持、恢复或进步人体组织的功能5。组织工程的理想支架材料应该具备如下条件：有良好的组织相容性；生物可降解性；无免疫原性；具有多孔性和高空隙率，利于细胞的贴附和生长，诱导组织再生；可塑性；有一定机械强度。而HAA作为一种天然细胞外基质生物材料，几乎具备以上各种生物特性，最有可能在组织体内完全再生，并可负载细胞生长。eller6将结膜细胞种植于羊膜上，BrdU标记后植入无胸腺鼠皮下，植入后14d

10、可以追踪到84%的标记细胞，同时其他指标也显示黏附于羊膜上的细胞具有干细胞特点，说明羊膜为干细胞提供了有利环境。本实验应用去污剂洗涤和酶消化的方法获得HAA，经过光镜和电镜检查，完全去除了细胞碎屑，降低了细胞免疫原性，又不损害HAA的胶原成分，采用TT法进展了细胞相对增殖性测定，细胞相对增殖率80%，细胞毒性级，符合生物材料的应用要求，因此是理想的支架材料。Ss与HAA在体外短暂培养2436h即可完成体外组织工程膀胱的构建，扫描电镜检查可见细胞黏附固定在支架材料上。重建膀胱的组织学显示，2时HAA移植物即已降解吸收，移行上皮和膀胱平滑肌开场形成。无论单独使用HAA还是使用Ss/HAA复合物进展膀胱替代，均没有发生移植排挤和坏死反响。比文献报道的应用无细胞膀胱基质厚约0.3进展膀胱替代吸收要早，炎性反响要细微。说明HAA组织相容性好，降解吸收快速完全且排挤反响细微。虽然A、B两组在膀胱容量上没有显著性差异，但组织学显示应用Ss/HAA复合物修补的