基因测序的前世今生一代测序二代测序三代测序最详原理

1、测序技术的前世今生 测序技术的进展历程 第一代测序技术（ Sanger 测序 ） 第一代 DNA 测序技术用的是 1975 年由桑格（ Sanger）和考尔森（ Coulson）开创的链终止法 或者是 1976-1977 年由马克西姆（ Maxam ）和吉尔伯特（ Gilbert ）制造的化学法（链降解） ,在 2022 年,完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的 Sanger 法为其测序基础； 原理： ddNTP的 3无羟基,其在 DNA 的合成过程中不能形成磷酸二酯键,因此可以用来中 断 DNA 合成反应, 在 4 个 DNA 合成反应体系中分别加入确定比例带有放射性同位素标记的 ddNT

2、P （分为： ddATP,ddCTP,ddGTP 和 确定待测分子的 DNA 序列； ddTTP）,通过凝胶电泳和放射自显影后可以依据电泳带的位置 其次代测序技术 NGS第一代测序技术的主要特点是测序读长可达 1000bp ,精确性高达 99.999%,但其测序成本 高,通量低等方面的缺点,严肃影响了其真正大规模的应用；经过不断的技术开发和改进,以 Roche 公司的 454 技术, illumina 公司的 Solexa,Hiseq 技术和 ABI 公司的 Solid 技术为标记的其次 代测序技术产生了； 其大大降低了测序成本的同时, 仍大幅提高了测序速度, 并且保持了高精确 性,以前完成一

3、个人类基因组的测序需要 3 年时间, 而使用二代测序技术就仅仅需要 1 周, 但在 序列读长方面比起第一代测序技术就要短很多, 1.illumina大多只有 100bp-150bp ； Illumina 公司的 Solexa 和 Hiseq 是目前全球使用量最大的其次代测序机器, 占全球 75%以上, 以 HiSeq 系列为主,技术核心原理都是边合成边测序的方法,测序过程主要分为以下 4 步： 第 2 页,共 5 页1）构建 DNA 测序文库 DNA 分子用超声波打断成 200bp-500bp 长的序列片段,并在两端添加上不同的接头； 2）测序流淌槽（ flowcell ） 结构： Flowc

4、ell 是测序的载体,课吸附 DNA 文库,每个 flowcell 有 8 条 lane,每个 lane 有 2 行 column ,每行 column 有 60 个 tail ,每个 tail 经 CCD 镜头课捕获荧光信 号； 第 3 页,共 5 页3）成簇（ cluster ） NGS 的核心技术特点,目的在于实现将单一碱基的信号强度进行放大,以达到 CCD 镜头 摄 取荧光的信号要求；大体原理网上都可查到,在此解答 2 大难懂得之处： 一可逆终止荧光 dNTPIllumina 测序核心技术 荧光修饰 dNTP 可逆合成终止 （ 包括 用叠氮基团 即起到了可逆终止作用和用不同荧光集团区

5、别碱基信号的功能 ） ,是 Illumina 测序的最核心技术； 第 4 页,共 5 页1. 上图是修饰过的 dCTP 分子结构式,在核苷酸糖基 3位连一个叠氮基团（ 红色基团 ）；这个 叠氮基团在链延长的时侯起到了 的 阻挡聚合 的作用（懂得见下图 DNA复制时的 5和 3的示意图, 下一个碱基合上时是： 下一个核苷酸的 5P 连接到上一个核苷酸的 3OH,故假如下一个核苷酸的 3带有叠氮基团而非自然状态下的 OH 时,下一个核苷酸就无法合上；） ； 2. 叠氮基团有一个特性, 就是遇到巯基试剂 （例如： 二巯基丙醇） ,叠氮基团会发生断裂, 并在原先的位置留下一个羟基因此在荧光照相之后可以借此回复 合上； 3的 -OH 状态,以供下一个碱基 3. 在碱基上,通过连接臂（ 蓝色基团 ）连接一个荧光基团