Decorin基因转染对人胃癌裸鼠移植瘤生长的影响

1、Decorin基因转染对人胃癌裸鼠移植瘤生长的影响 刘波，王川，胡在敏，季文，菜璨，亢渝俊，姜政(重庆医科大学附属第一医院消化内科，重庆 400016)【摘要】目的：探讨核心蛋白聚糖（Decorin，DCN)基因转染对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠移植瘤生长及肿瘤血管生成的影响。方法：构建裸鼠胃癌移植瘤模型，将重组质粒PEGFP-N1-DCN注入肿瘤中央及基底部，以空质粒组和生理盐水组作为对照，测量肿瘤体积和质量的变化，RT-PCR及Western blot检测DCN的表达差异，免疫组织化学染色方法检测血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VE

2、GF)的表达差异。结果：裸鼠胃癌移植瘤模型构建成功，与对照组比较，重组质粒组肿瘤生长速度减慢，肿瘤体积和质量明显变小(P0.05)；RT-PCR显示重组质粒组DCN表达明显增强，Western blot显示重组质粒组有融合蛋白的表达；免疫组化显示重组质粒组VEGF表达降低（P0.05)。结论：DCN基因可以抑制裸鼠移植瘤生长，抑制肿瘤新生血管形成可能是其抗肿瘤作用的机制之一。【关键词】核心蛋白聚糖；转染；胃癌；血管内皮生长因子【中图分类号】R735.2 【文献标识码】Effect of decorin gene transfection on human gastric carcinoma x

3、enograft growth in nude miceLiu Bo，Wang Chuan， Hu Zaimin，Ji Wen，Cai Can， Kang Yujun，Jiang Zheng (Department Of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital Of Chongqing Medical University,Chongqing 400016)Abstract Objective: To investigate the effect of decorin gene transfection on the growth and

4、angiogenesis of nude mice xenograft which bearing human gastric carcinoma cell SGC-7901. Methods: Gastric carcinoma xenograft model in nude mice was established, recombinant plasmid PEGFP-N1-DCN was injected to the center and bottom of the carcinoma, empty plasmid group and physiological saline grou

5、p as control groups, the change of carcinoma volume and weight was measured, the different expression of DCN was detected by RT-PCR and western blot, the different expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) was assessed by immunohistochemistry. Results: Gastric carcinoma xenograft model

6、 in nude mice was constructed successfully, compared with the control groups, slower growth speed, smaller volume and lighter weight was found in recombinant plasmid group (P0.05), RT-PCR showed that the expression of decorin gene in recombinant plasmid group was significantly higher than control gr

7、oups, western blot indicated that the expression of fusion protein was found in recombinant plasmid group, immunohistochemistry showed that the expression of VEGF was down-regulated in recombinant plasmid group (P0.05). Conclusion: Decorin gene can inhibit the 作者单位：400016 重庆医科大学附属第一医院消化内科通讯作者：姜政，gro

8、wth of nude mice xenograft, inhibition of angiogenesis may be one of the mechanism for antitumous effect.Key Words Decorin;Transfection;Gastric cancer;Vascular Endothelial Growth Factor胃癌是常见的恶性肿瘤之一，居我国消化道肿瘤的第一位，目前胃癌主要通过手术、化疗等方式进行治疗，但由于早期诊断率低，治疗效果欠佳，因此基因治疗为胃癌的治疗提供了新的思路。DCN属于细胞外基质成分，主要分布在结缔组织中，是一种细胞生长

9、的负性调节剂。此前我们已经成功构建PEGFP-N1-DCN重组质粒，为下一步工作奠定了基础。本实验通过转染DCN基因,观察该基因的高表达对裸鼠胃癌移植瘤生长的影响，检测其对肿瘤血管生长的作用，初步探讨DCN基因在肿瘤治疗中的作用及可能机制。1材料和方法1.1材料Balb/c-nu裸鼠购自重庆医科大学动物实验中心，pEGFP-N1质粒、E.coliDH5和SGC-7901胃癌细胞由重庆医科大学附属第一医院向廷秀博士惠赠，脂质体Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司，逆转录和PCR试剂盒均购于大连TaKaRa公司、质粒小量提取试剂盒及无内毒素质粒大量提取试剂盒购于美国

10、Omega公司，胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司，兔抗人VEGF多克隆抗体购自德国DATASHEET公司，兔抗人Decorin抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，免疫组化试剂盒购自北京百奥泰斯生物科技有限公司。1.2方法 1.2.1重组质粒的鉴定 将前期已经构建好的重组质粒pEGFP-N1-DCN进行双酶切（EcoR I和BamH I），酶切反应结束后加入10loading Buffer终止反应，酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。1.2.2动物模型的建立及分组 将用含10%胎牛血清的1640培养基培养在37，5%CO2孵箱内的SGC-7901胃癌细胞经胰酶消化后离心，用PBS清洗2次，

11、将细胞团块吹散，经台盼蓝染色证实细胞活力95%,胃癌细胞最终浓度为1107/ml。取细胞2106个(0.2 ml) 接种于裸鼠背部皮下组织内，动物饲养于层流罩内约4周，待肿瘤长至约7 mm4 mm4 mm (约50 mm3)时随机分为3组，即生理盐水组,空质粒组和重组质粒组，每组6只裸鼠，进行瘤内给药。具体方法是生理盐水组注射200 l生理盐水，空质粒组和重组质粒组注射质粒量为20 g/只1(按脂质体体积: DNA质量为2.5:1包裹并加入适量的不含血清的1640培养液混合)，终体积均为200 l，将200 l混合液向肿瘤基底部3点以及中央1点注射，每3 d注射一次，24 d后断颈处死裸鼠，部

12、分瘤组织用于匀浆提取总RNA，部分用于碾碎提取总蛋白，剩余部分用于制作石蜡切片。1.2.3肿瘤体积与瘤重分析 注射质粒前按公式V = 0.5ab2 (V代表肿瘤体积，a为长径，b为短径)监测裸鼠肿瘤体积，每3 d测量一次，绘制肿瘤体积增长曲线，24 d后断颈处死裸鼠，分离得瘤体，称重并绘制肿瘤质量差异图。1.2.4半定量RT-PCR检测DCN的表达差异 按照Trizol试剂盒操作说明提取肿瘤组织总RNA，所提总RNA溶于30 l无酶水中，Eppendorf核酸定量测定仪测定总RNA浓度和纯度，2%琼脂糖凝胶电泳观察总RNA完整性，将所提总RNA行RT-PCR反应，PCR反应条件为94预变性5

13、min，94变性30 s，60退火30 s，72延伸70 s，35个循环，72稳定5 min，4冷却保存。DCN的上游引物为5-CGGAATTCACATGAAGGCCACTATCATCCT-3，下游引物为5-CGGGATCCTTATAGTTTCCGAGTTGAATG-3，扩增产物大小为1080 bp，内参-actin上游引物为5-ACTGTGCCCATCTACGAGG-3，下游引物5-GAAAGGGTGTAACGCAACTA-3，扩增产物大小为678 bp，所用引物均由上海生工合成。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳分离后在凝胶成像仪上观察拍照，运用Quantity one软件对条带进行光密度扫描

14、，检测各组DCN扩增产物与其对应的内参-actin扩增产物灰度值，然后将比值进行统计学分析。1.2.5 Western blot检测DCN的表达差异 将部分裸鼠肿瘤组织匀浆碾碎，提取全细胞总蛋白质，进行Western blot检测，取50 g蛋白上样，进行SDS凝胶电泳，电转膜到PVDF膜上，封闭2 h后，以兔抗人DCN抗体及兔抗人tubulin-抗体为一抗4孵育过夜，次日以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗室温孵育1 h，化学发光试剂BeyoECL Plus显色，暗盒压片，显影定影，最后应用Bio-rad凝胶成像系统照相，采用Quantity one软件进行灰度值分析。 1.2.6免疫组化检测V

15、EGF的表达差异 24 d后断颈处死裸鼠，分离得瘤体，将肿瘤组织以4%甲醛固定，制成石蜡切片，进行免疫组化检测，步骤按照试剂盒说明进行。VEGF免疫组化结果判定：观察棕黄或棕褐色颗粒的分布情况，有棕黄或棕褐色颗粒且强度高于背景的非特异性着色为阳性细胞，细胞内无棕黄或棕褐色颗粒为阴性细胞。1.3统计学处理 采用SPSS18.0统计软件，实验数据用SD表示，计量资料采用单因素方差分析，P0.05表示差异有统计学意义，P0.01表示有显著的差异，P0.05表示差异没有统计学意义。2结果2.1重组质粒的鉴定 重组质粒pEGFP-N1-DCN双酶切后进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示重组质粒双酶切可见两个

16、条带，大片段与载体大小（4700 bp）一致，小片段与目的基因大小（1080 bp）一致，证实重组质粒构建成功（图1）。211000bp4000bp10000bp1080bp4700bp 图1 重组质粒双酶切鉴定结果 1：DNA标准10000；2：重组质粒双酶切产物2.2裸鼠体内成瘤实验和肿瘤体积与质量分析 人胃癌细胞SGC-7901接种 24 d28 d后全部裸鼠皮下成瘤，待肿瘤体积长至约50 mm3时，分别向3组裸鼠肿瘤组织注入等量的生理盐水,空质粒和重组质粒，每隔3 d天重复一次，共8次，每次注射前测量肿瘤体积并记录，最后绘制肿瘤体积增长曲线(图2)，24 d后断颈处死裸鼠，分离得瘤体并

17、称重，绘制肿瘤质量差异图（图3）。 图2 不同处理方法后的移植瘤生长曲线 图3 不同处理方法后的移植瘤质量差异 2.3RT-PCR检测目的基因的表达 将3组肿瘤组织RT-PCR反应产物行2%琼脂糖凝胶电泳，其结果显示重组质粒组DCN的表达明显增强，而空质粒组和生理盐水组DCN表达微弱且无明显差异，说明重组质粒在肿瘤组织中表达成功（图4）。 4321750bp2000bp678bp1080bp 图4 RT-PCR检测重组质粒在肿瘤组织中的表达 1：DNA标准2000；2：生理盐水组；3：空质粒组；4：重组质粒组2.4Western blot检测目的蛋白的表达 分别提取3组肿瘤组织总蛋白后行Wes

18、tern blot检测，化学发光试剂显色后可见3组细胞Tubulin-条带均清晰，DCN蛋白分子量约为40KDa，GFP分子量约为27KDa，融合蛋白GFP/DCN分子量约为67 KDa，本实验中重组质粒组在67 KDa处见一条带，而空质粒组和生理盐水组均无此条带，说明重组质粒在肿瘤组织中成功表达融合蛋白（图5）。321融合蛋白67KDa DCN Tubulin-40kDa49KDa 图5 Western blot检测重组质粒在肿瘤组织中的表达 1：生理盐水组；2：空质粒组；3：重组质粒组2.5免疫组化检测VEGF在肿瘤组织中的表达 光学显微镜下观察，VEGF阳性染色为棕黄色，定位于细胞质内，

19、重组质粒组裸鼠移植瘤VEGF表达较生理盐水组和空质粒组均降低（P0.05 )(图6）。 321 图6 免疫组化检测VEGF在肿瘤组织中的表达 1：生理盐水组；2：空质粒组；3：重组质粒组 3讨论 DCN属于细胞外富含亮氨酸的小分子PG家族（Smallleucine-m-rich proteoglycans, SLRPS），由糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)链共价连接于核心蛋白（Core protein）所组成的大分子糖复合物，其代谢异常或结构改变与许多疾病的病理过程有着密切的关系。在医学领域内，我们着重研究的是DCN作为一种细胞生长负性调节因子从而对多种肿瘤细胞增殖均有抑

20、制作用，同时它还可以降低细胞的迁移、侵袭能力。国内外的一些学者利用不同的方法克隆DCN基因，并将其与不同的载体进行连接，转染入不同的细胞或组织内以研究其功能2-4。真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点位于CMV的启动子与绿色荧光蛋白编码序列之间，CMV启动子可以增强DCN基因的表达，同时绿色荧光蛋白的表达能够清楚的显示真核表达载体的转染情况，pEGFP-N1-DCN重组质粒表达的融合蛋白兼具有DCN和EGFP蛋白的活性，对细胞没有毒性，同时便于转染后观察5-6，所有这些都为我们后续所做的动物实验奠定了坚实的基础，为我们进一步研究DCN基因的功能提供了有力的科学依据。 肿瘤生长及转移具有明确

21、的血管依赖性7，如果没有新生血管的形成，肿瘤细胞只能靠周围组织的弥散而获得O2和营养物质，其生长将受到明显限制，一旦在瘤灶内及其周围形成新生血管，肿瘤细胞就可经新生血管运输获得充足的营养物质而迅速生长，并通过血液循环把肿瘤细胞运输到其他部位，有研究表明，抗肿瘤血管生成能抑制结肠癌8、肺癌9、鼻咽癌10等恶性肿瘤的生长。肿瘤细胞自身产生的VEGF是重要的促血管生长因子，其可通过与其受体VEGFR1、VEGFR2结合，细胞内信号传导，诱导血管内皮细胞增殖和促进内皮细胞迁移，增加微血管通透性，加速血浆蛋白外渗，最终导致新的基质及新生血管腔形成。因此，应用转基因方法将血管生成抑制因子转入肿瘤细胞或组织

22、，就可以在肿瘤细胞或周围组织创造抑制血管生成的微环境11，从而有效抑制肿瘤生长12-13。在本实验中，我们成功构建了裸鼠胃癌移植瘤模型，观察转染重组质粒对裸鼠胃癌移植瘤生长的影响，并对其可能机制进行了初步探讨。结果表明，重组质粒组肿瘤生长速度较对照组减慢，裸鼠移植瘤生长受到一定程度抑制，而后我们采用了免疫组化方法观察DCN基因高表达对胃癌组织VEGF表达的影响，结果表明DCN抑制了肿瘤组织中VEGF的表达，这可能也是DCN发挥抗肿瘤作用的关键机制之一。参考文献：1 Gao LF, Zhang L, Hu JD, et al. Down-Regulation of signal transduc

23、er and activator of transcription 3 expression using vector-based small interfering RNAs suppresses growth of human prostate tumor in vivoJ. Clinical Cancer Research, 2005, 11(1): 6333-6341.2 Wu H, Wang S, Xue A, et al. Overexpression of decorin induces apoptosis and cell growth arrest in cultured r

24、at mesangial cells in vitroJ. Nephtology(catlton), 2008, 13(7): 607-615.3 赵春霞,赵萌涛,汪培华. 重组腺相关病毒介导核心蛋白聚糖基因转染对Siha细胞周期和凋亡的影响J.癌症, 2005, 24(1) : 28-324 RR Mohan, WM Stapleton, S Sinha, et al. Gene transfer into keratocytes inhibits alpha smooth muscle actin(SMA) expression and myofibroblast transformati

25、on invest Invest OphthalmalJ. Vis Sci,2006,47:18155 黄波,田大力,杨春鹿. ABCE1基因pEGFP重组表达载体构建及转染小细胞肺癌J. 现代肿瘤医学,2009;17(3):393-3976 马俊,陈明浩,窦科峰,等. pEGFP-N1-linamarase重组真核表达载体的构建及linamarase在MH-CC97中的表达J. 第四军医大学学报,2008,29(7):577-580 7 Staton CA,Stribbling SM,Tazzyman S,et al. Current methods for assaying angioge

26、nesis in vitro and in vivo. Int J Exp Pathol,2004,85:233-2488 Dkhissi F,Lu H,Soria C,et al. Endostatin exhibits a direct antitum or effect in addition to its antiangiogenic activity in colon cancer cells. Hum Gene Ther,2009,14:997-10089 Kurdow R,Boehle AS,Ruhnke M,et al. Retroviral endostatin gene tra