LPS对HaCaT细胞表达IL-15的影响及其作用机制探讨

1、LPS对HaCaT细胞表达IL-15的影响及其作用机制探讨陶千山 罗欣 黄海良 张晓玲 贾波 张胜权（230032合肥, 安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室）摘要 目的 探讨LPS对HaCaT细胞表达IL-15的影响及其对信号通路的激活改变。 方法 11000ng/ml不同剂量LPS分别刺激HaCaT细胞2h和24h后，Real-time PCR分析LPS对HaCaT细胞IL-15mRNA表达的影响；100ng/ml LPS分别刺激HaCaT细胞48h和0.5h后，Western-blot分别分析LPS对HaCaT细胞IL-15蛋白、NF-B的表达影响和ER1/2、AKT的激活改变。 结果

2、 LPS（11000ng/ml各剂量组）明显下调HaCaT细胞IL-15mRNA水平的表达，但LPS（100ng/ml）却显著诱导HaCaT细胞IL-15蛋白的表达。信号通路分析显示LPS明显活化HaCaT细胞信号蛋白ER1/2、AKT和NF-B进而影响IL-15mRNA的表达，而且这种作用能被相关的信号蛋白特异性抑制剂阻断。 结论 LPS通过激活MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路而调节IL-15在HaCaT细胞中的表达。关键词 LPS；IL-15；ER1/2；AKT；HaCaT细胞基金项目 安徽省重点实验室优秀中青年科研带头人专项基金（2007年度）通讯作者 张胜权，电话：（0

3、551）5161194，E-mail： HYPERLINK mailto:sqz36 sqz36Effect and mechanism of LPS on IL-15 expression in HaCaT cells TAO Qianshan, LUO Xin, HUANG Hailiang, ZHANG Xiaoling, JIA Bo, ZHANG Shengquan（Department of Biochemistry and Molecular Biology, Anhui Medical University，Hefei，Anhui Province, 230032，China）

4、Abstract Objective To explore the effect of LPS on the expression of IL-15 in HaCaT cells and its effect on signal pathways. Methods HaCaT cells were treated with different concentrations (11000ng/ml) of LPS for 2h and 24h, and then the expression of IL-15 mRNA induced by LPS was measured by Real-ti

5、me PCR. HaCaT cells were respectively treated with LPS (100ng/ml) for 48h and 0.5h for Western blot analyzing the expression of IL-15 protein, NF-B and the activation of ER1/2, AT induced by LPS. Results LPS (11000ng/ml) significantly down-regulated the mRNA expression of IL-15, however, LPS (100ng/

6、ml) obviously induced the production of IL-15 protein. Results of signal pathways studying demonstrated that LPS induced activation of ER1/2, AT and NF-B to influence the expression of IL-15 mRNA, and this effect was blocked by specific signal proteins inhibitors. Conclusion LPS regulates the expres

7、sion of IL-15 in HaCaT cells by activating the signal pathways of MAPK/ER1/2 and PI3K/AT.ey words LPS; IL-15; ER1/2; AT; HaCaT cellsSupported by the Special Fund for Anhui Key Laboratory of Outstanding Young Leaders (2007). Corresponding author: Zhang Shengquan, Tel: 86-551-5161194, E-mail:sqz36白细胞介

8、素（IL）-15是一类重要的促炎症因子，在机体天然免疫中发挥着重要的调节作用1，其异常表达与许多免疫性疾病密切相关2，如IL-15的高表达在银屑病的发生发展中起到重要作用3。IL-15基因位于染色体4q31，跨度大概34kb，含9个外显子；成熟的IL-15是一种114个氨基酸残基组成的糖蛋白，由其基因的第5-8个外显子所表达产生，为一种四-螺旋束结构4。IL-15受体（IL-15R）属于造血因子超家族，由、三个亚基组成，其中和亚基与IL-2R共用5，他们的信号通路部分重叠，主要参与MAPK/ERK1/2和Jak/STAT等信号通路6。IL -15基因表达各水平存在着一定差异，目前研究发现许多组

9、织和细胞在未受任何刺激的情况下均表达IL-15mRNA，而IL-15蛋白质的表达主要表达于活化细胞，尤其是受到各种微生物代谢物刺激的细胞7。同时，IL-15基因表达还受到多种因素的复杂调控，尤其是转录起始水平的单核巨噬细胞功能刺激因子调控，转录后水平的5非翻译AUG以及特异性信号肽调节8。目前研究普遍认为脂多糖（LPS）可以明显诱导心、肺、肾、肝等组织和外周血单核细胞、自然杀伤细胞等多种细胞类型高表达IL-159-10，但是LPS对HaCaT细胞（HaCaT细胞为永生化的人角质形成细胞系，是体外研究银屑病发生发展机制的良好模型）IL-15表达的影响目前还不清楚。本研究意在探讨LPS对HaCaT

10、细胞表达IL-15的影响及其信号通路激活改变。1 材料和方法1.1 材料与试剂 HaCaT细胞株为本室冻存，胎牛血清和DMEM培养基购自GIBCO公司， LPS购自Sigma公司，Trizol购自Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒购自Promega公司，Real-time PCR试剂盒购自TaKaRa公司， （P-）ER1/2、（P-）AT、NF-B、和-ACTIN抗体购自Santa Cruz公司，二抗购自中杉金桥公司，ECL购自PIERCE公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养 HaCaT细胞复苏后用含10%胎牛血清的DMEM培养基置37、5%CO2孵箱培养。1.2.2 Real-

11、time PCR检测IL-15 mRNA水平表达LPS（11000ng/ml）、ERK1/2特异性抑制剂PD98085（100uM）、AKT特异性抑制剂LY294002（50uM）分别干预HaCaT细胞至预定时间后用Trizol裂解细胞，酚-氯仿提取总RNA，经70，10min变性后，以oligo(dT)为引物用Promega逆转录试剂盒经42，60min；95，5min将其逆转录成cDNA。根据表1引物进行Real-time PCR（相对定量）扩增，反应条件为:95，15s；60，40s，40个循环，然后以2-CT法计算、分析实验结果。表1：Real-time PCR引物序列基因引物序列GA

12、PDH上游引物5-CCACATCGCTCAGACACCAT 下游引物 5-GGCAACAATATCCACTTTACCAGAGT IL-15上游引物5-TTTCTAACTGAAGCTGGCATTCAT下游引物5-CCAGTTGGCTTCTGTTTTAGGAA1.2.3 Western blot检测IL-15蛋白表达及信号蛋白激活改变LPS（100ng/ml）、PD98085（100uM）、LY294002（50uM）分别干预HaCaT细胞后，用PBS洗涤细胞2次，加入全细胞裂解液200L，冰浴20min。用细胞剐棒剐下细胞收集于0.5mlEP管中，加入5上样缓冲液50L，混匀，100水浴5分钟。

13、然后4，12000g离心10分钟，取上清。12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白；150mA电流1.5h将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭1h；一抗（NF-B，1:250；（p-）ER1/2、（p-）AKT、-ACTIN，1:500）4过夜，TBS-T洗膜三次；二抗（1:10000）室温1h，TBS-T洗膜三次；涂ECL，曝光压片。1.3 统计学处理 数据以表示，使用SPSS 11.0进行统计学分析；组内各数据采用方差分析，组间数据采用t检验。 2 结果2.1 Real-time PCR检测LPS诱导的HaCaT细胞中IL-15mRNA的表达图1所示，不同剂量（1、10、30、100、10

14、00ng/ml）LPS作用HaCaT细胞2h与空白对照组相比均抑制IL-15mRNA水平的表达（P0.05），且存在剂量效应关系；随着刺激时间的延长，除1000ng/ml组外，24h时间点LPS对HaCaT细胞IL-15mRNA水平的抑制作用较前更明显（P0.05），但各剂量组之间无明显差异。图1：Real-time PCR检测不同浓度LPS诱导HaCaT细胞IL-15mRNA的表达2.2 Western blot检测LPS诱导的HaCaT细胞中IL-15蛋白的表达图2所示，100ng/ml LPS刺激HaCaT细胞48h后，Western blot分析发现无刺激条件下HaCaT细胞无可检测水

15、平的IL-15蛋白表达，而LPS能显著诱导IL-15蛋白的产生。这提示LPS对HaCaT细胞表达IL-15在mRNA水平和蛋白水平具有不同的调节作用。图2：Western blot检测LPS诱导HaCaT细胞IL-15蛋白和NF-B的表达2.3 信号蛋白ER1/2、AT和NF-B激活改变与LPS诱导HaCaT细胞IL-15表达100ng/ml LPS刺激HaCaT细胞48h后，Western blot分析发现LPS显著激活NF-B（p65亚基）的表达（图2）。信号通路研究表明（图3所示），ERK1/2特异性抑制剂PD98085（100uM），AKT特异性抑制剂LY294002（50uM）均能完

16、全抑制HaCaT细胞的ER1/2和AT磷酸化，同时100ng/ml LPS刺激HaCaT细胞30min后能显著促进ER1/2和AT磷酸化为p-ERK1/2和p-AKT，但这种作用能分别被PD98085和LY294002阻断。PD98085（100uM）、LY294002（50uM）单独刺激，或先分别处理HaCaT细胞1h再加入LPS（100ng/ml）刺激24h，同时设立单独LPS（100ng/ml）24h刺激组，然后用Real-time PCR分析IL-15mRNA的表达变化。其结果如图4所示，当阻断ER1/2的磷酸化后，LPS对HaCaT细胞IL-15mRNA表达的抑制作用明显解除（P0.

17、01）；而阻断AKT的磷酸化后，LPS对HaCaT细胞图3：Western blot检测LPS和抑制剂对HaCaT细胞ERK1/2、AKT的激活影响IL-15mRNA表达的抑制作用较前也有降低（P0.05）。这些结果提示ER1/2和AT可能作为一个负相关性调控因子参与了LPS对IL-15mRNA表达的抑制。图4：ERK1/2、AKT激活改变与HaCaT细胞IL-15mRNA表达3 讨论LPS作为革兰氏阴性菌细胞壁的主要组成成分，主要通过LPS结合蛋白（LBP）与LPS受体（mCD14或sCD14）形成三联复合物（LPS-LBP-CD14）11，或直接/间接作用于Toll样受体(TLRs，主要是

18、TLR4)通过MyD88依赖/非依赖途径12，进而激活MAPK/ERK1/2、Jak/STAT、p38和NF-B等信号通路将信号从胞外传到胞核刺激多种细胞合成和释放TNF-、IL-1、 IL-6等经典生物活性物质而表现出复杂的生物学活性13，在机体的自身防御反应、内毒素性休克、全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭等生理病理过程中具有重要作用。IL-15作为一种促炎症因子，与银屑病等自然免疫性疾病关系密切，有关IL-15表达调控的研究在机体自然免疫研究中越来越受到重视。本研究发现，LPS抑制HaCaT细胞IL-15mRNA水平的表达，并且具有剂量和时间依赖性，然而LPS却又显著诱导HaCaT细胞产

19、生和分泌IL-15蛋白。Real-time PCR分析发现不同剂量LPS均抑制IL-15mRNA的表达，且随着作用时间的延长其抑制作用越见明显。Western blot分析发现HaCaT细胞在未受刺激条件下没有可检测水平的IL-15蛋白产生，但100ng/ml LPS明显诱导其高水平表达IL-15蛋白。这些结果说明LPS对HaCaT细胞表达IL-15具有明确的影响，但是在mRNA和蛋白表达水平的表现上又有所不同，提示LPS对IL-15不仅在转录水平上有调控且在转录后水平同样也存在着复杂的调控，其可能的机制之一可能是非分泌型的IL-15蛋白机制了IL-15基因在转录水平的表达14。信号通路研究表

20、明，LPS能显著诱导信号蛋白ER1/2和AT的磷酸化而与IL-15mRNA在HaCaT细胞中的表达负相关，且这种作用能被PD98059和LY294002阻断，提示LPS确实能够通过MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路调节HaCaT细胞IL-15的表达。 综上所述，我们发现LPS体外显著抑制HaCaT细胞IL-15mRNA水平的表达和诱导HaCaT细胞IL-15蛋白水平的表达，并初步探讨了其作用机制，发现MAPK/ERK1/2、PI3K/AKT和NF-B信号通路参与其中。但动物实验结果是否和体外实验结果一致，以及是否有其他信号通路的参与，还有待进一步深入研究。参考文献1 Ohtei

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