治疗性工程抗体的研究进展

1、治疗性工程抗体的研究进展【摘要】单克隆抗体从问世到应用于临床，经历了一段曲折的开展历程，其中基因工程抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新。利用抗体工程技术可研制出性能和特点各不一样的高效治疗性抗体，如增强效应功能的全长抗体、传递细胞毒作用的免疫毒素、抗体与细胞因子连接的交融蛋白，以及锚定多种受体的双特异抗体等。本综述介绍了近年来治疗性抗体工程的进展。【关键词】工程抗体；治疗性抗体；双特异抗体；效应功能Prgressandappliatinfne-styleengineeringantibdyusedfrtherapeuti【Abstrat】hennlnalantibdyesin

2、tbEing，ithasbeenanunevenayinitsidelylinialappliatins.Buttheengineeredantibdysetsaniprtantilestneithaseriesftehnlgyrenvatins.Adiversityfengineeredantibdyfrshavebeenreatedtiprvetheireffiay,inludingenhaningtheeffetrfuntinsffull-lengthantibdies,deliveringtxinstkillellsrytkinesinrdertstiulatetheiunesyste

3、,andbispeifiantibdiesttargetultiplereeptrsandsn.Thereviealstfusesnthisneprgressfengineeringantibdyusedfrtreatent.【Keyrds】engineeringantibdy;therapeutiantibdy;bispeifiantibdy;effetrfuntin为了合适临床应用，对Ab必须进展适当的改造或修饰，以降低或去除人体对Ab的免疫反响，增强Ab的功能。在降低免疫原性方面，Ab经历了鼠源单抗、鼠/人嵌合单抗、人源化单抗、人源单抗等几个阶段，鼠源性蛋白的成分逐步减少，最终下降为零。

4、Ab免疫原性下降延长了在体内的半衰期，使长期治疗成为可能。对Ab改造的另一个方向是让其携带某种特定的分子，如同位素、细菌毒素、炎性细胞因子、趋化因子或药物前体分子等，起到靶向杀伤肿瘤细胞的作用。此外，对Ab分子构造进展改造，增加与抗原的结合才能和抗体效应功能，也是新型治疗性抗体研究的重要方向1,2。1双特异抗体(Bispeifiantibdy，BsAb)BsAb是指具有两种抗原结合特性的抗体，可同时结合两个不同的抗原或抗原决定簇。与Ab相比，BsAb具有以下优点：(1)较低浓度即可杀伤或溶解肿瘤细胞；(2)对低表达或不表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞有杀伤或抑制作用；(3)激活结合的细胞毒性T淋巴细

5、胞(yttxiTlyphyte，TL)，发挥多种生物学效应，协助杀伤肿瘤细胞。早期研制BsAb的方法是采用细胞工程，即将两株各自分泌不同特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞再交融得到四源杂交瘤(quadra)，或将一株杂交瘤细胞与免疫的脾细胞交融得到三源杂交瘤，这两种杂交瘤被称为二次杂交瘤(hybrid-hybrida)。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反响(HAA)，因此不适用于临床。20世纪90年代起，基因工程和蛋白质工程在抗体消费和改造中得到了成功应用，由此产生了抗体工程。应用抗体工程消费BsAb，具有分子量孝方法稳定、可大量消费、本钱显

6、著降低和操作简便等优点。1996年，Ridgay等人3首次将“knbsinthles技术应用到BsAb异源双聚体形成的制备上，此后erhant4和Xie5进一步开展了该技术。“knbsinthles的设计思路很巧妙，主要是通过突变两条重链结合面上的某些氨基酸，使原来无法结合的免疫球蛋白Ig重链结实结合。通常采用的方法是：将一条IgG重链上H3构造域中的氨基酸突变为带小侧链的氨基酸(hle)，将另一条IgG重链上与之相对应的氨基酸突变为带大侧链的氨基酸(knb)，然后共转染编码这两条重链的基因至同一真核宿主细胞表达。由于knb和hle氨基酸特殊的互相作用，使两条重链形成的二聚体可以到达90%以上

7、。2022年，XieZ等5应用该技术先将抗人表皮生长因子2(HER2/neu)和抗D16两个单链可变区抗体在同一H细胞中实现表达，然后应用人IgG1F段的H3构造域将两者结合，形成异源二聚体形式的BsAbs，该二聚体具有特异性结合HER2/neu和D16的功能。与其它哺乳细胞表达的工程BsAbs相比，该BsAbs产量较高(1214g/L，体外实验显示可以发动人外周单核细胞杀灭SK-BR-3肿瘤细胞，作用明显强于罗氏公司消费的商品化抗HER2/neu抗体Hereptin。全长型BsAb分子中含有F段，由于它可以结合F受体(FR，一种细胞外表的细胞毒效应触发分子)，故可激活免疫系统的效应细胞以杀死

8、肿瘤细胞。应用抗体工程改造BsAb，使其与FR结合才能进步，亦是BsAb研究的一个重要方面。经过改造，BsAb可以与IgA受体(FRI)发生高亲和力结合，其作用甚至强于抗FR的BsAb对肿瘤细胞的杀伤作用6。2抗体细胞因子交融蛋白(Antibdy-ytkinefusinprteins)细胞因子能激活某些免疫细胞，包括单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、T细胞和B细胞等。应用细胞因子治疗癌症可以引起免疫应答，但这种免疫反响是非特异的，常产生全身毒性。有人尝试使用抗体工程技术将细胞因子与抗体连接形成交融蛋白，通过靶向作用，细胞因子在肿瘤组织的靶细胞上聚集，在部分杀伤肿瘤细胞，而非特异性毒性将减少或消失7

9、。常用的细胞因子包括IL-2、IL-12和G-SF等，交融的部位可以是全长型抗体或SFv的N端或端。抗体细胞因子交融蛋白作为一种新型的肿瘤免疫治疗药物，其抗体功能域可引导细胞因子浓集在肿瘤组织的微环境中，之后抗体部分直接抑制肿瘤细胞活性，并诱导二次免疫应答，多重作用的相加使抗体细胞因子交融蛋白对肿瘤的抑制作用明显强于单独使用抗体或细胞因子。由于全长型抗体F上存在两个效应细胞结合位点，功能更为强大，其中一个位点与细胞因子结合，激活效应细胞，另一个与FR结合，引发抗体依赖细胞的细胞毒作用(Antibdy-dependentellularyttxiity，AD)。近年来已有多种抗体细胞因子交融蛋白问

10、世，如抗体IL-2交融蛋白8和抗体IL-12交融蛋白，后者是将抗纤连蛋白SFv的重链构造域N端与IL-12交融，结果产生较强的抗肿瘤活性，这主要是因为该交融蛋白显著增加了免疫效应细胞对肿瘤的浸透，并增强了T细胞对肿瘤细胞的排挤反响9。有人还研制出可以同时与两种细胞因子交融的抗体，即抗体的N端和端分别连接了不同的细胞因子(IL-2、IL-12、IL-4或G-SF)，抗肿瘤的功能更加显著10。这些进展证明抗体细胞因交融蛋白有着广阔的使用前景。3免疫毒素(Iuntxins，ITs)ITs是一种毒素肽和细胞选择性靶向配体连接的交融蛋白，它能通过靶向构造域的特异结合功能使毒素传递到靶细胞并与之作用进而杀

11、死肿瘤细胞。早期的ITs是由无修饰生物毒素和鼠源抗体如全长IgG连接而成的，连接的方式常为化学偶联法。由于非人源的毒素和鼠源抗体导致的免疫排挤反响，以及低亲和力和无靶向特异性，使ITs无法在临床中得到运用。新型ITs是将毒素肽和细胞选择性靶向配体都进展改造后，再用工程菌或工程细胞实现高效表达。细胞选择性靶向配体使用了工程抗体、转铁蛋白、表皮生长因子以及IL-2等11。抗体的改造主要集中在降低免疫原性、进步亲和力和增强实体肿瘤渗入率等方面，包括改用小分子工程抗体Fab、SFv/dsFv、人源化抗体、人源抗体和突变的高亲和力抗体等。ithellH等12通过对人抗体的胚系基因热点突变gerlineh

12、tspt，得到了亲和力显著进步的人源噬菌体抗体库挑选表达的SFv。通过比照现有抗体DNA序列和抗体库中的胚系基因，可以找出位于DRpleentaritydeteriningregin的突变热点RGYRA/G，Y/T，T/A基序，这些基序与胚系基因一致的是胚系热点，与体细胞突变序列一致的是非胚系热点或体细胞突变热点。研究说明，胚系热点数越多，抗体亲和力越低。突变含多个胚系热点的抗体基因，将使其亲和力大大进步。D.Vallera等人13用低聚集连接短肽(Aggregatinreduinglinkers，ARL)代替经典的Gly4Ser连接短肽，以毒素肽VHARLVLGly4SerVHARLVL的连

13、接形式构建了一种新型的二价单链抗体毒素交融蛋白Bi3。与一价ITs相比，Bi3因减少了前体蛋白的聚集反响，增加了折叠正确的SFv蛋白形成，加上二价结合力，因此具有更强的亲和力。HeD等14利用精氨酸富集肽具有促进细胞内化作用的特点，设计出的ITs中含有九个精氨酸短肽，增强了内化作用，使ITs药效得到了进步。以往ITs常用的生物毒素有15：(1)细菌毒素，如白喉毒素和假单胞菌外毒素；(2)植物来源的核糖体失活蛋白(RIP)，如蓖麻毒蛋白和天花粉蛋白；(3)真菌毒素，如sarin等。新一代的生物毒素那么是经过修饰后降低了免疫原性的毒素肽，如用聚乙烯乙二醇修饰的毒素，人源化毒素等，完成了从传统免疫毒

14、素治疗到抗体导向酶前体药物治疗Antibdydiretedenzyeprdrugtherapy，ADEPT的跨越。例如，蓖麻毒素A能引发血管渗漏综合征Vasularleaksyndre，原因是它有一个与血管内皮细胞结合的三氨基酸构造域位点，引导了蓖麻毒素A与内皮细胞结合，然后发挥出毒性作用。假如将该构造域突变，可使它与内皮细胞结合才能明显下降，因此毒性也明显下降16。一种从海葵里提取的溶细胞素StihlysinI，也可用来做ITs的毒素功能域，因为它有强烈的细胞膜孔化作用，可以使肿瘤细胞破裂17。4抗体的效应功能Ab能产生四种效应功能：AD、吞噬作用、补体依赖的细胞毒作用(pleentdepe

15、ndentyttxiity，D)、影响半衰期或去除率。AD和吞噬作用是由抗体与FR互相作用介导的，D那么通过细胞外结合的抗体与启动补体效应的蛋白互相作用造成的，半衰期效应那么是由于抗体与新生F受体(NenatalFreeptr,FRn)结合引起的。针对AD、吞噬作用及D抗体效应功能的抗体工程主要集中在对F的改造上，以增强抗体与FR的互相作用，最终增加效应功能。全长型抗体有两个N糖基化位点，它们介导了F与FR结合诱发的AD效应，进而也诱导了FR相连的细胞，活化了细胞毒性T淋巴细胞yttxiT-lyphyte，TL的应答反响。通过基因突变和糖基异构的方法，优化F和FRs互相作用，能增强抗体抑制肿瘤

16、的作用。IgG297Asn的糖基化构成了寡聚糖连接中心，与其连接的盐藻糖能连接多种单糖，盐藻糖部分缺失能显著增强抗体与FRIII的结合才能及继发的AD效应。Katsuhirr等18运用RNA干扰技术，在中华仓鼠卵巢细胞H中下调IgG糖基化关键酶盐藻糖基转移酶8a1,6fusyltransferase，FUT8的表达，使抗体去盐藻糖化，结果该抗体的AD效应增强了100倍，该H的表达特性还可以遗传至子代细胞。此外，完好的人源IgG1与FR结合的氨基酸序列图谱的成功解析，有助于研制各种IgG1突变体，以进步它们与FR结合的才能。这些突变体甚至能与低亲和力的FRIIIA高效结合，并使AD效应增强19。

17、IgG的另一效应功能是半衰期效应。通过改变F残基，可以到达延长半衰期的目的，并进步抗体与FRn的结合才能。人IgG和FRn抗原决定簇互相作用的空间构造已解析，对其部分关键残基改造后，可以增强它们的结合强度以延长半衰期。FRn从构造上来说是HI型分子，由一个链和一个2微球蛋白以非共价形式结合。FRn在脑微血管系统表达，功能是将脑组织中的IgG运输到血液。工程改造后不结合FRn的抗体可用来治疗脑癌，原理是减少抗体从脑入血的运出率。必须注意的是，IgG与FRn的结合与pH值亲密相关，两者只能在pH6.0时结合，pH7.4那么不行20。近年来，抗体新效应功能也受到关注。Basta等21发现不含F区的F

18、(ab)2也可诱导抗体的效应功能，进一步研究发现F(ab)2中的恒定区可以与过敏毒素3a或5a，补体3和补体5的蛋白酶消化片段起中和反响，激发效应细胞的效应功能。当非特异IgG与3a或5a作用时，也发现有很强的效应功能，分子模拟研究说明它们之间的结合位点不包含F区。5结论利用抗体工程研制更有效的治疗性抗体的前景非常光明。理论已经证明，许多新型工程抗体可以在原核或真核细胞中实现高效表达，它们具有较长的半衰期和生物学效应，大多为SFv、Fab或它们的多聚体，可以有效进入肿瘤细胞，具有比拟理想的治疗效果。新型抗体工程技术的不断出现，将为抗体改造提供了强有力的技术平台。相信不久的将来，治疗性抗体会在人

19、类疾病的治疗中扮演重要的角色。【参考文献】1iseanGA,LEighB,ErinD,etal.RadiatindsietryresultsfrZevalinradiiuntherapyfrituxiab-refratrynn-Hdgkinlypha.aner,2002,94(4Suppl):1349-1357.2FishelsnZ,DninN,ZellS,etal.bstalestaneriuntherapy:expressinfebranepleentregulatryprteins(RPs)inturs.lIunl,2022,40(2-4):109-123.3RidgayJB,Prest

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