《生化分离工程》第七章 层析分离技术

1、第七章 层析分离技术1主 要 内 容第一节 概述第二节 凝胶层析第三节 离子交换层析第四节 疏水作用层析第五节 亲和层析第六节 高效液相色谱2第一节 概述1.1 层析简介 层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。31903年，M.Tswett用碳酸钙分离色素的示意图Tswett分离叶绿素的经典色谱过程41.2 层析技术的分类1.2.1 按两相所处的状态分类液体作为流动相，称为“液相色谱”（liquid

2、chromatograp-hy）；用气体作为流动相，称为“气相色谱”（gas chromatogr-aphy）。固定相也有两种状态，以固体吸附剂作为固定相和以附载在固体上的液体作为固定相，所以层析法按两相所处的状态可以分为： 液固色谱（liquid-solid chromatography） 液液色谱（liquid-liquid chromatography） 气固色谱（gas-solid chromatography） 气液色谱（gas-liquid chromatography） 51.2.2 按层析过程的机理分类吸附层析利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。分配层析

3、利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数（或溶解度）不同，而使之分离的方法。凝胶层析利用某些凝胶对于不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异，进行分离的技术。6吸附层析的种类物理吸附层析离子交换层析亲和层析疏水作用层析金属螯合层析有机染料层析71.2.3 按操作形式不同分类 柱层析（colum chromatography）将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。 纸层析（paper chrmatography）用滤纸作液体的载体（担体support），点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析（thin layper chromatography）将适当粒度的吸附剂

4、铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。8 在层析过程中，流动相起运载作用，固定相起阻滞作用，不同的物质根据其在两相中的分配系数进行分配。 Kd=Cs/Cm。 K值大，表示某种物质牢固地吸附在固定相中，溶质出现在流动相中较晚。反之亦然。 在不同类型的层析中， K值的含义也不同。吸附层析中Kd为吸附平衡常数；分配层析中Kd为分配系数；离子交换层析中Kd为交换系数；亲和层析中Kd为亲和常数。1.3 层析技术原理与术语9色谱的名词术语色谱术语 ：A、基线：B、峰高：色谱峰顶与基线间的垂直距离，以h表示。C、保留值：死时间tm：不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需

5、的时间。因为物质不被固定相吸附，故其流动速度将与流动相的流动速度相近：保留时间tr：试样从进样到柱后出现峰极大点时所经历的时间。调整保留时间tr：.10tr的表达：时间单位(如s, d, h), 距离单位(如cm)，体积(ml, l)表示。tr意义：色谱法定性的基本依据，但同一组份的tr常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定。D、死体积VM：指色谱柱内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和，当后两项很小而可忽略不计时， VM可由 tm与流动相体积流速F0(ml/min)计算：E、保留体积VR：指从进样开始到被测组份在柱后出现

6、浓度极大点时所通过的流动相体积。保留体积与tr的关系如下：F、调整保留体积VR：某组份VR扣除VM后，称该组份的VR ，即色谱的名词术语11G、相对保留值2,1：某组份2与组份1的调整保留值之比，即：由于2,1只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，如GC、HPLC中，广泛使用的定性数据。注意：2,1绝不是两个组份保留时间或保留体积之比在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标值(s), 然后再求其它峰(i)对这个峰的相对保留值。此时r,i 可能大于1，也可能小于1。在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，将它们的相对保留值作为重要参数。

7、在这种特殊情况下，可用符号a表示： 式中tr,2为下一峰的调整保留时间，所以这时a总是大于1。色谱的名词术语12H)、分配比k, 即容量因子：意义：色谱柱对组份保留能力的重要参数k与m的关系：4)、区域宽度色谱主峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：A、标准差：0.607倍峰高处峰宽的一半。B、半峰宽Y1/2：峰高一半处对应的峰宽。它与的关系为C、基线宽度Y：色谱两侧拐点上的切线在基线上的截距。它与的关系是色谱的名词术语13色谱曲线反映出的重要信息：A、根据色谱峰的个数，可以断样品中所含组份的最少数；B、根据色谱峰的保留

8、值(或位置)，可以进行定性分析；C、根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析；D、依据色谱峰的保留值及其区域宽度，评价色谱柱分离效能；E、色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据。14色谱理论 两组份完全分离必须满足：A、两组份的分配系数必须有差异；B、区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；C、在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。15塔板理论 塔板模型:将色谱柱视为精馏塔，即色谱柱是一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板高(plate high)为H。假设在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前转移。对一长为L的色

9、谱柱，溶质平衡的次数应为：n称为理论塔板数(theoretical plate number)。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随塔板高H的增大而减小。n与半峰宽及峰底的关系式为: 式中tr(或Y1/2)应采取同一单位(时间或距离)。上式示：在tR一定时，如果色谱峰越窄，则说明n越大，H越小，柱效能越高。16例1 已知某组分峰的峰底宽为40S，保留时间为400S，计算此色谱柱的理论塔板数。例2 已知一根1米长的色谱柱的有效塔板数为1600块，组份A在该柱上的调整保留时间为100秒，试求A峰的半峰宽及有效塔塔板高度。171 平衡关系分布系数Kd= Cs/CmCs： 溶质在固

10、定相中的溶度Cm：溶质在流动相中的溶度 溶质在固定相中的量K (容量因子)= 溶质在固定相中的量K = Kd （为相比）18阻滞因数（Rf值）Rf = = 保留值保留时间 tR、保留体积 vR 柱高 （L） t0（死时间） = tR = t0（1 + k） 线速度（） 分离度 tR2 tR1R = W1+ W2流动相在色谱系统中的移动速度Am + Kd As（固定相的平均截面积）溶质的移动速度Am（流动相的平均截面积）191.4 层析技术的流程装柱缓冲溶液平衡上样收集洗脱活性检测20实验室用的层析柱工业用的层析柱21自动馏分收集仪（国产）自动馏分收集仪（进口）22蠕动泵23国产柱层析系统24伯

11、乐公司（BIO-RAD）柱层析系统25发玛西亚公司（Pharmacia）柱层析系统26表面涂有硅胶层的玻璃板溶剂（流动相）点样点样品迁移方向带盖玻璃缸溶剂前沿薄层层析示意图27第二节 凝胶层析 凝胶层析又称为分子筛层析或凝胶过滤，是使混合物流动相经过固定相凝胶的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而分离的技术。 具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。28良好的凝胶过滤介质应具备的条件：亲水性高，表面惰性稳定性强，使用寿命长具有一定的孔径分离范围机械强度高29常用填料Sephadex系：是以氯代环氧丙烷进行交联的葡聚糖珠状凝胶。经典的凝胶介质Se

12、pharose系:经过纯化的琼脂糖，含极少的带电集团。型号最多、应用最广Sephacryl系：有是丙基葡聚糖与N,N-亚甲基双丙稀酰胺共聚而成。经济高效Superdex系：是葡聚糖与琼脂糖共聚而成的复合凝胶。最新，选择性强，分辨率极高30（一）原理 凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。3132（二）葡聚糖凝胶的种类与性能 葡聚糖又

13、名右旋糖酐，在它们的长链间以三氯环氧丙烷交联剂交联而成。葡聚糖凝胶具有很强的吸水性，交联度大，吸水性小，相反交联度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交联度越大，吸水性越小，G值越大，交联度越小，吸水性就越大，二者呈反比关系，G值大约为吸水量的10倍。由此可以根据床体积而估算出葡聚糖凝胶干粉的用量。33表 Sephadex1的种类与特性型号分离范围（分子量）吸水量（ml/mg）最小溶胀时间（h）床体积（ml）/干凝胶（mg）20-25100G10 7001.00.13123G15 1,5001.50.2312.53.5G25 5,0002.50.23146G501,500-

14、20,0008.00.331911G753,000-70,0007.50.52411215G1004,000-15,0000101.07211520G1505,000-800, 000151.5721203G2005,000-3000,000202.0721304034（三）试验方法1凝胶的选择 根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶，如除盐和除游离的荧光素，则可选用粗、中粒度的G25或G50，G250多用于分离蛋白质单体，G200多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。2凝胶的预处理 称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。35表1

15、10 凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量 层析柱规格凝胶的规格和用量（g）直径（cm）高（cm）容量（ml）G25 G50G100G2000.9159.52.510.60.30.93019521.20.60.960381042.51.21.620401042.51.21.640802085.02.41.67014035149.04.41.6100200502012.562.64021050201272.670370903520122.62.6100605301 0001302505011030701735 表 凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量 363装柱 层析柱的选择一般根据分离

16、样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的410倍。 柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为15125；对于纯化蛋白质来说应为1201100。374加样与洗脱 样品体积不宜过多，最好为床体积的15%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。 洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会

17、发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.020.1Mol/L pH 6.98.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。5洗脱液收集及检测386凝胶柱的重复使用与保存 当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方法有三种： 在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰）或高压灭菌后4保存。此法至少可以保存半年以上。 用完后，以水冲洗，然后用60%70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。

18、长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于6080干燥后保存。39凝胶过滤层析的特点优点：可测定蛋白质分子量可研究蛋白质二聚体或寡聚体的存在可用于蛋白质的脱盐洗脱操作条件温和，产品收率可接近100%易实施循环操作，提高产品纯度不足：选择性低，料液处理量小需要具有浓缩作用的单元操作40凝胶过滤层析的应用分离纯化脱盐相对分子量的测定41第三节 离子交换层析 阴离子交换凝胶本身带有正电荷基团，阳离子交换凝胶本身带负电荷基团。由于静电相互作用而使样品结合到凝胶上，再采用盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进行

19、洗脱 对于等电点小于5.0的酸性蛋白质，推荐使用阴离子交换，对于等电点大于7.0的碱性蛋白质，推荐使用阳离子交换。 两种模式：一种使目的蛋白结合凝胶，通过梯度洗脱；一种使目的蛋白不结合凝胶，而大部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有目的蛋白。 42DEAE-Cl 蛋白质DEAE-Cl + DEAE- 蛋白质NaCl蛋白质Cl阴离子交换色谱原理4344层析条件pH：阴离子交换层析：蛋白质带负电荷，则要求pHpI，但不能高于介质功能基团的pK；阳离子交换层析：蛋白质带正电荷，则要求pHpI，但不能低于介质功能基团的PK；缓冲溶液：阴离子交换层析：Tris-HCl阳离子交换层析：PBS上样：上样量；盐浓度

20、45吸附速度：洗脱方式：改变离子强度、PH等/线性梯度洗脱阶段/逐次洗脱洗脱速度：阶段洗脱可尽量大；梯度洗脱需根据出峰情况调整。46强酸和强碱型交换剂能在较为广泛的pH范围内(pH1-pH14)完全解离。弱酸型交换剂在低于pH4，弱碱型交换剂在高于pH9就难于解离，因而失去交换能力。阳离子交换剂阴离子交换剂根据可交换的离子的性质强酸型强碱弱酸弱碱根据酸碱性的强弱离子交换剂的分类47离子交换剂的选择考虑因素：酸碱强弱：由功能基团决定稳定性再生性经济具有三维空间立体结构的网络骨架连接在骨架上的活性基团活性基团所带的相反电荷的活性离子（可交换离子）48常见类型纤维素类：无定形，分辨率和稳定性都较低

21、葡聚糖系：体积和流速受PH值、离子强度影响较大；琼脂糖系：最常用聚乙烯醇系(Toyopearl)：全合成的苯乙烯系（Source）：流速快，分辨率高49离子交换层析的优点料液处理量大，具浓缩作用应用范围广产品回收率高商业化的离子交换剂种类多，价格较低50常见问题分析不吸附：缓冲溶液pH不对；离子强度太高；峰形不稳或出现奇异峰：柱床中有气泡或缓冲溶液不纯分辨率低：梯度太大；流速太高前沿峰：柱过载；填充效果差；柱需再生峰拖尾：样品在柱滤膜上或凝胶床顶部沉淀基线随梯度上移：盐浓度临近CMC51 （1）原理第四节 疏水作用层析疏水层析是利用表面偶联疏水性基团的疏水性吸附剂为固定相，根据生物分子与固定相

22、之间疏水作用力的差别进行分离的层析方法。 52疏水层析技术示意图53离子强度及种类破坏水化作用的物质表面活性剂温度 （2）影响疏水性的条件54（3）疏水层析操作要点 根据试验目的及样品特点选择合适的疏水胶：要选择能完全吸附目的蛋白质，但洗脱条件又比较温和的柱材料。 吸附条件的选择：上柱样品中应含一定浓度的中性盐，以增加溶质与疏水胶的相互作用。一般要求在较高的离子强度（4 mol/L,NaCl）下吸附蛋白质。各种盐对疏水作用的影响由其化学性质决定。55 洗脱条件的选择：选择原则：直接破坏疏水作用；通过改变蛋白质的构象作用洗脱方法：改用低盐析效应的盐降低离子强度加乙二醇降低洗脱液极性在洗脱液中加去

23、污剂增加洗脱pH上述洗脱方法有的通常由高到低的NaCl浓度梯度洗脱，或由高到低的盐浓度梯度加由低到高的乙二醇浓度梯度洗脱56柱的再生 再生的目的是除去紧密吸附的蛋白质和残存去污剂。经验证明按下述方法有效： 2倍柱床体积水 1体积乙醇2体积正丁醇1体积乙醇1体积水再用初始缓冲液平衡吸附剂57疏水层析的特点由于在高浓度盐溶液中疏水性吸附作用较大，因此疏水层析可直接分离盐析后的蛋白质溶液。 可通过调节疏水配基链长和密度调节吸附力，因此可根据目标产物的性质选择适宜的吸附剂。疏水吸附剂种类多，选择余地大。 58疏水作用层析的应用互换酶的分离蛋白质亚基与蛋白质聚合物的分离多肽与蛋白质碎片的分离59定义：亲

24、和层析是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子与其配体之间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。 例如：酶和酶的抑制剂、抗原和抗体、蛋白质和辅酶之间有一种特殊的亲和力，在一定条件下它们能紧密结合成复合物。如果将复合物的某一方固定在不溶性载体上，则可以从溶液中专一性地分离和提纯另一方。第五节 亲和层析60亲和层析原理 先将待提纯蛋白质的特异配基，通过适当的化学反应共价地连接到象琼脂糖凝胶一类的载体的功能基上。一般在配基与多糖基质之间插入一段所谓连接臂使配基与凝胶之间保持足够的距离，不致因载体表面的空间位阻而防碍待分离的大分子与配基的结合。 当待提纯的蛋白质样品加到这种多糖材料的层析柱上时，待提

25、纯的蛋白质就会有特异的配体结合，而其他的蛋白质，因对这个配体不具有特异的结合位点，将通过柱子 而流出。而特异地结合到柱子上的蛋白质可用自由配体分子（含游离配体的溶液）洗脱下来。61621 亲和层析的一般问题 1.1 配基的选择将一对能可逆结合和解离生物分子的一方与水不溶载体相偶联制成亲和吸附剂，这样一对生物分子中，被偶联的一方就叫作配基。在实际工作中，究竞选择哪一种物质作配基，要根据分离对象和实验的具体情况而定。纯化酶选择酶的竞争性抑制剂、底物、辅酶和效应剂作配基。纯化酶的抑制剂选择相应的酶做配基。纯化能结合维生素的蛋白质，选择与其专一结合的维生素做配基。631.2 载体的选择 将亲和配基共价

26、偶联在固体粒子的表面(或孔内)即可制备亲和吸附介质，该固体粒子通常称为配基的载体。因此，亲和吸附介质又称亲和载体。作为载体的固体粒子应满足下列要求：(1)具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大 (2)物理和化学稳定性高，较高的机械强度，使用寿命长(3)含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化；(4)粒径均一的球形粒子64手臂的选择具有与载体和配体进行偶联反应的功能基团。要能经得起偶联、洗脱等操作过程的化学处理和条件的变化。亲水，但又不能带电荷。一般对臂有如下要求：651.3 基质活化和偶联 大部份基质在偶联抗体之前，均需要进行化学活化。活化基质通常经过与抗体表面残基的-NH反应将抗体

27、偶联，偶联反应也可通过与抗体表面的-0H、-C00H或-NH进行。 在小配体的亲和色谱中，间隔臂常插在基质和配体之间，以尽量减少空间位阻对蛋白质与其配体相互作用的影响。当配体本身就是蛋白质大分子，因此，空间位阻将不会阻碍抗体与抗原的相互作用。 最常使用的基质活化方法是溴化氰法。用溴化氰活化多糖类基质具有简单、效果好的特点。许多活化好的、稳定的基质已商品化。661.4 洗脱问题 非特异洗脱的方法，通过改变洗脱液的PH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质使固定化配基和生物高分子之间的亲和力降低，以至解开生物高分子和亲和吸附剂之间的结合。 特异洗脱的方法，利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的

28、小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。 另一种洗脱的方法是利用配基通过重氮键或硫脂键连接在载体上的这一特点，当吸附生物大分子以后，可以用还原剂断裂重氮键或断裂硫脂键，从而得到生物大分子和配基的络合物，然后将络合物解离，再分出欲纯化的生物大分子。67亲和层析的优缺点是分离蛋白质的一种极为有效的方法是最有效的生物活性物质纯化方法仍有些非特异的吸附，且配基易脱落进入分离体系载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难68金属离子亲和层析（IMAC）基本原理 通过Cu2 +、Co2 +、Zn2 +、Ni2 +等过渡金属离子与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色

29、氨酸的吲哚基配位结合，利用蛋白质表面这些氨基酸的种类、数量、位置和空间构象的不同所导致的与金属螯合物的亲和力大小的不同，选择性地对蛋白质加以分离纯化 。693.2 固定化金属离子亲和层析柱的制法 将柱子浸没于某种金属离子(如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+)缓冲液中，直至螯合到固定相上的金属离子和溶液中的金属离子达到平衡。固相载体，通常是多聚物(如交联化的琼脂糖，葡聚糖)，配位体(亚氨基二乙酸，IDA)共价连接当在缓冲液中浸泡平衡后，经洗涤，可将含有生物活性物质的样品上柱，与固定化金属配基有亲和力的分子都将被滞留，其余则流出柱外。70 IMAC的应用 近二十年来，国外在IMAC分离纯化蛋

30、白质方面的主要研究结果列于下表。 近年来，IMAC广泛应用于基因重组技术产生的蛋白及多肽的分离纯化。在欲分离的蛋白表面接上对金属离子有亲和性的氨基酸（如组氨酸、半胱氨酸、色氨酸）或螯合肽（如组氨酸色氨酸、组氨酸组氨酸），促进蛋白质的分离和纯化。对基因工程重组蛋白的纯化，常通过基因工程人工合成多组氨酸残基尾巴(常为6His尾巴)，添加到蛋白质的N-末端或C-末端，这种基因工程蛋白与料液中的其他蛋白质相比，对金属离子有更高的特异性，在分离纯化后再用化学法或酶法将尾巴切掉。71蛋白质来源金属离子过氧化氢酶牛肝FeD-乙内酰脲酶细胞溶解物Cu细胞色素C 和溶菌酶大肠杆菌细胞抽提物Cu 磷蛋白牛奶Ga绿

31、色荧光蛋白大肠杆菌细胞抽提物Cu/Ni/Co/Zn果胶酶植物（Biocon Plus）Cu泌乳刺激素大肠杆菌培养物Ni生长激素大肠杆菌培养物Cu生物素标记的蛋白质没有生物素标记的相似物Pt表 固定金属离子亲和色谱分离蛋白质 72胶原纤维固化铁从蛋清粉中吸附分离溶菌酶 吸附前蛋白质起始浓度为0.97mg/mL,洗脱液中蛋白质浓度最高为4.8mg/mL,约为原蛋白质浓度的5倍，说明胶原纤维固化铁固定床对蛋白质具有富集作用。吸附前蛋白质溶液的溶菌酶酶活很低(100U/mL),洗脱液的最高酶活可达4.84104U/mL，说明洗脱液中溶菌酶的浓度远远高于蛋白质起始溶液中的。 初次使用的固定床与再生固定床

32、对溶菌酶的回收率分别为70.5和70.0。从蛋清粉中分离纯化溶菌酶73胶原纤维固化锆从蛋清粉中吸附分离溶菌酶吸附前蛋白质浓度为1.0mg/mL,洗脱液中蛋白质浓度最高为3.9mg/mL，约为原蛋白质浓度的4倍，说明胶原纤维固化锆固定床对蛋白质具有富集作用。吸附前蛋白质溶液的溶菌酶酶活很低(100U/mL),洗脱液的最高酶活可达4.72104U/mL，说明洗脱液中溶菌酶的浓度远远高于蛋白质起始溶液中的。 初次使用的固定床与再生固定床对溶菌酶的回收率分别为68.7和68.4。 从蛋清粉中分离纯化溶菌酶74高效液相色谱法检测分离后溶菌酶的纯度 胶原纤维固化铁固定床和胶原固化锆固定床吸附分离后溶菌酶的

33、纯度均为100。 从蛋清粉中分离纯化溶菌酶753.3 固定化金属离子亲和层析的优点 和传统的亲和层析相比，固定化金属离子亲和层析具有以下优点：(1)配基稳定性高，不易脱落；(2)金属离子配基价格低廉，再生成本低；(3)可在高盐浓度下操作，从而省去了脱盐的预处理步骤，而且可以减少非特异性吸附；(4)蛋白质洗脱比较容易，采用较低pH或采用竞争性物质如咪唑,EDTA,便可将吸附蛋白解吸下来。76IMAC与其他亲和层析相比具有以下优点： (1)蛋白质吸附容量大，是天然配基结合量的1O-100倍； (2)价格便宜，投资低； (3)具有普遍适用性金属离子配基具有很好的稳定性，吸附容量大，成本很低，且层析柱

34、可长期连续使用，易于再生。 (4)洗脱条件温和77 固定化金属离子亲和层析的缺点 金属离子亲和层析与免疫亲和层析比较起来，对蛋白质的特异性差，会发生非特异性吸附，结合常数K在104105之间。 另外，螯合在亲和载体上的金属离子在操作过程中有可能脱落而混入产品中，严重影响产品质量螯合。78第六节 高效液相色谱 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。 为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行

35、比较： 79 1高效液相色谱法与经典液相色谱法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。 高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cmmin-1。802高效液相色谱法与气相色谱法 （l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20。对于占有机物总数近80的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。 (2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。

36、而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。81 (3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 高效液相色谱法的仪器设备

37、费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。 82高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构示意见图，一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。 其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 8384 1高压输液系统 高压输液系统高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵

38、是核心部件。 对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。 常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。852进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约530cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色

39、谱法中对进样技术要求较严。 863 分离系统色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。 一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（20m）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。 874检测系统 在液相色谱中，有两种基本类型的

40、检测器： 溶质性检测器：仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。 总体检测器：对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。88 （l）紫外检测器 (2) 荧光检测器 (3) 示差折光率检测器 几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达10-7gcm-3。主要缺点是对温度变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 (4) 电导检测器 (5) 附属系统 包括脱气、梯度淋洗、恒温、自动进样、馏分收集以及数据处理等装置。其中梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中尤为重要的附属装置 . 89高效液相色

41、谱的固定相和流动相 固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.O1081.O109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。 固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。 90表面多孔型固定相 其基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。 这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋

42、洗时能迅速达平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受限制。 91全多孔型固定相 它由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。也可由氧化铝微粒凝聚成全多孔型固定相。 这类固定相由于颗粒很细（510m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。92 93流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。 （2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。所谓

43、溶剂的紫外截止波长指当小于截止波长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明的，它严重干扰组分的吸收测量。表20-2列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。9495(3) 高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加50100nm。(4) 化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。(5) 低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检