分子发光分析法课件

1、分子发光分析法分子发光分析法分子发光分析法分子发光分析法分子吸收能量，电子由基态进入激发态，当电子由 激发态返回基态时发射光谱。光子(h ) 阴极射线 X 射线 热超声波 粒子流 化学反应光致发光(M*) 阴极射线发光 X射线发光 白炽发光声纳发光 离子发光化学发光(M*)M M+热量M+ h +热量F荧光磷光 P分子发光：分子吸收能量，电子由基态进入激发态，当电子由 激发态返回基态一 荧光与磷光荧光分析法历史：16世纪，人们已经观察到当紫外和可见光照射到某些物质 时，这些物质就会发出不同强度的光，而当照射停止时， 物质的发光就随之很快消失1852年，斯托克斯(Stokes)给出了上述现象的解

2、释：分子荧光1864年，斯托克斯提出荧光可用于分析1867年，荧光成功地用于测定铝20世纪，荧光分析仪器面世一 荧光与磷光荧光分析法历史：荧光分析法的特点：最大优点：灵敏度高，检出限通常比分光光度法低2-4个数量级选择性要优于分光光度法能产生较强荧光的化合物相对较少，其应用不如分 光光度法广泛许多重要的生物物质都具有荧光性质，该方法在药 物、临床、生命科学研究等领域具有重要意义荧光分析法的特点：最大优点：灵敏度高，检出限通常比分光光度法1荧光及磷光的产生机理012基态(S )激发态(S 、S 、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射； 量子化；跃迁一次到位振动转动分子电子 hc /( 电子 振动

3、 转动 ) h (电子 振动 转动 )E E E EE2E1E0 1 2 1. 2分子能级与跃迁,2,1,0J00 21 3J032 1J 02 31J0321分子紫外吸收光谱 分 子 可 见 吸 收 光 谱分子红外吸收光谱1荧光及磷光的产生机理012基态(S )激发态(S 1.2电子激发的单重态和三重态受激分子的电子激发态可以归纳为两种状态：激发态单重态跃迁后自旋方向 不改变，S=0 M=1跃迁后自旋方向 改 变 ；S=1 M=3基态S0S0S0激发态三重态S1T1自旋配对 S=0 M=2S+1=1电子从S0 S 分子能量相应增加改变了分子对称性、 分子净的电子自旋（多重性）发生改变（S0T

4、1）1.2电子激发的单重态和三重态激发态单重态跃迁后自旋方向 洪特规则:平行自旋比成对自旋稳定, 三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态S0T1 禁阻跃迁；通过其 他途径进入(见能级图)； 进入的几率小第一、第二、电子激发三重态 T1 、T2 ；洪特规则:第一、第二、电子激发三重态 T1 、T2 ；T1hAhA紫 外 可 见 吸 收10-15 s振动松驰, VR, 10-1210-14 s(同一多重态振动能级间)内转换, IC, 10-1110-13 s (相同的多重态间)内系统窜跃, ISC, 10-210-6 s(不同的多重态之间)S0S1S23 2 1 010-8

5、s荧光hF磷光10-3100 shP外转换 ,EC(不同电子能态间)T1hAhA紫 外 可 见 吸 收10-15 s振动松驰1.3 激发态基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光磷光内转化外转化系间窜跃振动弛豫无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大荧光：10-710-9 s，第一激发单重态的最低振动能级基态 磷光：10-410 s；第一激发三重态的最低振动能级基态；1.3 激发态基态的能量传递途径电子处于激发态是不稳定状态非辐射能量传递过程：振动弛豫：同一电子能级内以热

6、能量交换形式由高振动能 级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12- 10-14 s。内转化：相同多重态的电子能级之间的非辐射跃迁。内转化 过程的速率在很大程度上决定于相关能级之间的能量差，相 邻单重激发态之间能级较近，其振动能级常发生重叠，内转 化很快通常不论分子被激发到哪一个电子激发态，在10-12-10-13 s内 通过内转换和振动弛豫，都会跃迁到第一激发单重态的最低 振动能级。非辐射能量传递过程：振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形非辐射能量传递过程：外转化：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用 而转移能量的非辐射跃迁；外转化使荧光或磷光减弱或 “猝灭”系间窜跃：不

7、同多重态、有重叠的振动能级间的非辐射 跃迁。改变电子自旋，通过自旋-轨道耦合进行。属于禁 阻跃迁，因而跃迁速率小得多，使得三重态有较长的寿 命，约为10-3-10 s，发出磷光非辐射能量传递过程：外转化：激发分子与溶剂或其他分子之间产生3 2 1 0hAhA紫 外 吸 收S0S1S2荧光hF 1 2 2辐射能量传递过程：荧光发射：电子由第一激发单重态 的最低振动能级基态（ 多 为 S1 S0 跃迁），发射波长 为 2的荧光；10-710 -9 s由右图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长要长； 2 2 13 2 1 0hAhA紫 外 吸 收S0S1S2荧光 T1hAhA吸收振动驰豫内转

8、换系间跨越S0S1S23 2 1 0磷光hP磷光发射：电子由第一激发三 重态的最低振动能 级基态（T1S0跃 迁）S0 T1属于禁阻跃 迁，不能发生，电 子由S0进入T1的可能 过程？发光速度很慢： 10-310 s 。光照停止后，可持 续一段时间。S0激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫T1T1hAhA吸收振动驰豫内转换系间跨越S0S1S23 2荧光和磷光的异同点:相同点：均属于辐射跃迁，光致发光不同点： 荧光：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（S1 S0跃迁），发光速度：10-710 -9s 。磷光：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（T1 S0跃迁），发光速度很慢： 10- 41

9、00 s 。显著特点：光照停止后，可持续一段时间。荧光和磷光的异同点:ex =290nm (MAX)2、荧光(磷光)光谱2.1 荧光(磷光)的激发光谱曲线固定发射波长扫描激发波长固定em（发射波长)=640 nm48004400400036003200280024002000160012008004000IF200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似ex =290nm (MAX)2、荧光(磷光)光谱2.1 IF4800 44004000360032002800240020001600

10、12008004000200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900em= 620nm(MAX)2.2发射光谱(荧光光谱)固定激发波长扫描发射波长固定ex=290nm (MAX)IF4800 4400200 250 300 350 402.3激发光谱与发射光谱的关系IF48004400400036003200280024002000160012008004000200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900em=290nm（MAX）ex=620nm（M

11、AX）1.Stokes位移激发光谱与发射光谱之间的波长差值称为斯托克位移通常由于振动弛 豫消耗了能量， 发射荧光的能量 比分子吸收的能 量小发射波长较激发波长长； ex em2.3激发光谱与发射光谱的关系Iem=290nm（MA1324FFExcitation spectrumEmission spectraem2.发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量所产生但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光，发射光谱与受激发的波长无关。1324FFExcitation spect固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm (MAX

12、)IF48004400400036003200280024002000160012008004000200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900S04321S143211 41 31 2111 41 31 21 13. 镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样） 成镜像对称关系。基态上的各振动能级分 布与第一激发态上的各 振动能级分布类似. 从 基态最低振动能级跃迁 至第一激发态各振动能 级吸收的激发光波长间 隔与从第一激发态返回 基态各振动能级发射的 荧光波长间隔相似！吸收光谱中某一振动带 的跃迁几率

13、大，其发射 光谱中的跃迁几率也大固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm (M2.4磷光光谱与发射光谱相同条件下的磷光光谱激发光谱发射光谱IF48004400400036003200280024002000160012008004000200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 9002.4磷光光谱与发射光谱相同条件下的磷光光谱激发光谱发射光VB1和VB2的三维荧光光谱VB1和VB2的三维荧光光谱3分子荧光与分子结构的关系a荧光强度 (If )吸收的光量子数吸收的光强 (I)f 发射的光量子数3.1荧光的量子产率分子

14、在吸收紫外和可见光后，激发态分子是以辐射跃迁 还是非辐射跃迁回到基态，决定了物质是否能发荧光。通常以荧光效率（或荧光量子产率）来描述辐射跃迁概率的大小荧光效率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如 外转换过程速度快，不出现荧光发射；3分子荧光与分子结构的关系a荧光强度 (If )吸收的光量化合物F0.110.290.460.600.52fikF:荧光发射的速率常数，主要取决与荧光物质的分子结 构；ki:相关过程的速率常数总和,主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。大多数具有分析应用价值的荧光物质的量子产率在0.11之间；例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F=0.55；荧光素F=

15、1fK KK f化合物F0.110.290.460.600.52fifK具有合适的结构；具有一定的荧光量子产率。3.2分子产生荧光必须具备的条件具有合适的结构；3.2分子产生荧光必须具备的条件3.3分子结构与荧光3.3.1 跃迁类型与共轭效应分子只有能够吸收紫外-可见光，才有可能发荧光！n * max 100* max104*是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。发荧光的分子必须能产生*跃迁，必须有共轭双键这样 的强吸收基团，且共轭体系越大，电子的离域性越强，越 易被激发而产生荧光大部分能发荧光的分子中都含有一个以上的苯环，随共轭 芳环增大，荧光效率提高，荧光峰向长波方向移动。如萘 荧光效率为0

16、.29，荧光波长为310 nm，而蒽荧光效率为 0.46，荧光波长为400 nm3.3分子结构与荧光3.3.1 跃迁类型与共轭效应3.3.2 刚性结构分子的刚性平面结构有利于荧光的产生！刚性平面结构可减少分子的振动和碰撞去活的可能性如荧光素与酚酞：荧光素在0.1 M氢氧化钠中荧光效率高 达0.92，而酚酞没有氧桥，不易保持刚性结构，不易产生 荧光COO-OCOO-产生荧光F=0.92荧光黄CCOO-OO不产生荧光酚酞3.3.2 刚性结构分子的刚性平面结构有利于荧光的产生！CONNNN不产生荧光产生荧光CH2OHCH3H3C萘VAF(萘)= 5F(VA)偶氮菲偶氮苯NNNN不产生荧光产生荧光CH

17、2OHCH3H3C萘VA3.3.2 取代基I取代基的类型给电子取代基吸电子取代基卤素取代基3.3.2 取代基I取代基的类型重原子中能级 交叉严重，容 易发生自旋轨 道的耦合使 S1T1的系间 窜跃显著重原子中能级 交叉严重，容 易发生自旋轨 道的耦合使 S13.3.2 取代基I取代基的类型给电子基如-OH、-NH2、-NR2、-OR 、-CN 等可产生p 共轭，使共轭体系增大，导致 荧光增强吸电子取代基如-COOH、-NO、-NO2等不产 生 p 共轭，使荧光减弱卤素取代基中卤素原子序数的增加，物质的荧 光减弱，而磷光增强3.3.2 取代基I取代基的类型II取代基的位置反式二苯乙烯空间位阻对荧

18、光发射的影响H3CNCH3-O3SH3CNCH3 SO3-F=0.75F=0.03CC HHC HH C立体异构体对荧光发射的影响顺式二苯乙烯强荧光物质非荧光物质II取代基的位置反式二苯乙烯空间位阻对荧光发射的影响-O3III 电离效应对荧光发射的影响OHO-OHO-OH-H+OH-H+pH=1, 有荧光pH=13, 无荧光pH9.5 强荧光em=429nmIII 电离效应对荧光发射的影响OHO-OHO-OH-OH-T1hAhA紫 外 可 见 吸 收10-15 sS0S1S23 2 1 010-8 s荧光hF磷光10-3100 shPT1hAhA紫 外 可 见 吸 收10-15 sS0S1I0

19、T e2.303 bCA lgT lg It bC ,4分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系4.1荧光强度与浓度的关系光吸收定律（Lambert BeerLaw）相应的吸光分数为：I0 1 T 1 e2 .303bC1 It2.303bC I0 (1 e)I f I0 ItI0T e2.303 bCA lgT IF ( I0 It) I0 ( 1 e2 .303bC)按照级数展开式：1!2!3!4!n!xx 2x 3x4xnxe 1 荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：2!3!4! )( 2.30bC )2( 2.30bC )3( 2.30bC )4IF I0 ( 2.30bC IF

20、( I0 It) I0 ( 1 对于稀溶液，当 bc 0.05（磷光 bc 0.01）时：IF 2.30 kF I0 b CFI-荧光强度F-荧光量子产率b-吸收光程-摩尔吸光系数C-荧光物质浓度IF K C对于稀溶液，当 bc 0.05（磷光 bc 13, 无荧光pH2, 无荧光OH-H+OHO-OHO-OH-H+OH-H+pH=13, 无荧光pH9.5强荧光pH=1, 有荧光NH32NH -NH4+pH=7-12, 蓝色荧光pH13受pH影响的金属螯合物的荧光NOHONZn8-羟基喹啉弱荧光8-羟基喹啉-Zn螯合物黄绿色强荧光NNOOAlNNOHHO2,2-二羟基偶氮苯 无荧光2,2-二羟

21、基偶氮苯-Al螯合物 强荧光pH不仅影响螯合物的形成，也 影响螯合物的组成，即影响其荧 光性质受pH影响的金属螯合物的荧光NOHON8-羟基喹啉8-羟基喹表面活性剂：使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率溶解氧：氧分子具有顺磁性质，溶解氧使激发单重态分子向三重态的系间窜跃速率加大，使荧光效率降低。其它顺磁物质也有这种作用表面活性剂：使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，4.2.4 内滤光作用和自吸现象内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光

22、谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。4.2.4 内滤光作用和自吸现象内滤光作用：溶液中含有能吸收4.2.5荧光的熄灭荧 光 熄 灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用 引起荧光强度降低或消失的现象。荧光熄灭剂：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。碰撞猝灭与分子的直径、粘度、温度等因素有关。静态猝灭转入三重态猝灭体系中引入溴或是碘，都是高效率的猝灭剂。如曙红（四碘荧光素） 的荧光产率比荧光素低发生电荷转移反应的猝灭荧光物质的自猝灭当荧光物质的浓度大于1g/L时，常发生荧光的自熄灭(浓度熄灭)4.2.5荧光的熄灭荧 光 熄 灭：荧光分子与溶剂分子或其5.1荧光分光光度计光源激发单

23、色器样品池检测器数据处理 仪器控制1基本结构测量荧光的仪器 分为四部分： 激发光源、样品池、双单色器系统、 检测器。特殊点：两个单色器,光源与检测器通常成90度直角发射单色器5.1荧光分光光度计光源激发单色器样品池检测器数据处理 仪仪 器 光 路 图仪 器 光 路 图分子发光分析法问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？紫外-可见分光光度计:光源单色器样品池检测器数据处理 仪器控制荧光(磷光)分光光度计:光源样品池激发 单色器检测器数据处理 仪器控制发射单色器问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？光源单二 光源光源的要求：发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波

24、长的变化小有足够长的使用寿命常用气体放电灯类型： 氙灯光源高压汞光源二 光源光源的要求：氙灯光源波长范围：2001000nm工作压力：520 atm启动电压：2040KV使用寿命：10002000h最广泛应用的连续光源： 发射波长范围宽发射光强度大氙灯光源波长范围：2001000nm最广泛应用的连续光源：高压汞灯光源应用广泛的线光源：253.7296.5302.2312.6313.2365.0365.5366.3404.7435.8546.1557.0579.0(nm )激光器可调谐染料激光器是发光分 析的理想光源应用波长范围 330-1020nm高压汞灯光源253.7296.5302.231

25、2.6313.三. 单色器平面衍射光栅，干涉滤光片四.检测器光电管，光电倍增管，二极管阵列， CCD及光子计数器五.样品池：液池、荧光池问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光 光度计的样品池有什么区别？三. 单色器平面衍射光栅，干涉滤光片紫外-可见分光光度计 测量池(吸收池)荧光分光光度计 样品池I0ItI0ItIF,p紫外-可见分光光度计 测量池(吸收池)荧光分光光度计 样品池1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样2. 吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光荧光分光光度计的样品池四面透光3. 使用注意事项波长范围容易破碎沾污问题1.样品池的材料：与紫外-可见分

26、光光度计的吸收池一样3. 使1. 特点灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2 4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1 0.1g/cm3相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；试样量少提供比较多的物理参数缺点：应用范围小。5.2荧光分析法的特点及应用1. 特点5.2荧光分析法的特点及应用2.定量依据与方法FCsFxCx荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高103104.(1)定量依据-荧光标准曲线法标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条 件下测量未知试样的荧光强度，在 标准曲线上求出浓度；比较法：在

27、线性范围内，测定标样和试样 的荧光强度，比较；2.定量依据与方法FCsFxCx荧光分析的灵敏度比紫外可见3 荧光分析法的应用(1)与有机试剂形成配合物后测量；可测量约70多种元素铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与 发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生 荧光熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。3 荧光分析法的应用(1)与有机试剂形成配合物后测量；可测量铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定某些元素虽然与有机试剂形成发荧光的配合物，但是反应速度 慢，在某些微量元素的催

28、化下，反应速度会加快或是催化发荧 光的配合物产生荧光熄灭，在特定的时间内可用来测定微量元 素。铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮 -196铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定分子发光分析法芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定 的主要类型。(2) 有机化合物待测物试剂 exmaxemmax测定范围ppm丙三醇苯胺紫外蓝色0.12糠醛蒽酮4655051.515氨基酸氧化酶3154250.0150维生素A无水乙醇345490020蛋白质曙红丫紫外5400.066肾上腺素乙二胺4205250.00

29、10.02青霉素-甲氧基-氯-(-氨 乙基)-氨基氮杂蒽4205000.06250.625玻璃酸梅3-乙酰氧基吲哚3954700.0010.033胍基丁胺邻苯二醛3654700.055四氧嘧啶苯二胺36548510-4芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定 的主(3) 荧光检测在色谱分离中的应用纸色谱或薄层色谱分离中斑点的定位色谱分离的荧光检测器，灵敏度比通用的紫外检测 器高2-3个数量级。衍生化方法(3) 荧光检测在色谱分离中的应用纸色谱或薄层色谱分离中斑点(4) 荧光免疫分析荧光免疫分析法：用荧光物质做标记的免疫分析法荧光标记物质:荧光素量子点(4) 荧光免疫分析荧光免疫分

30、析法：用荧光物质做标记的免疫分荧光量子点的用途：观测活细胞里多个蛋白质的活动。量子点现已可取 代传统染色法，成为细胞内的荧光标记物，可进行长 时间、多分子同时检测。荧光标记： 这种新型荧光材料的出现为众多生物问 题的研究带来的曙光。量子点可与多种分子进行偶联， 如Protein A、抗体、链霉亲和素等，作为荧光探针， 检测特定靶分子的分布和功能。活体示踪：克服了传统标记物毒性高、易淬灭、光 线穿透能力差的缺陷。通过与靶标的偶联，实现长时 程观测活体生物的生理和病理进程以及活细胞内生物 大分子间的相互作用。荧光量子点的用途：观测活细胞里多个蛋白质的活动。量子点现已可量子点标记后蝌蚪胚胎分化的不同

31、阶段量子点标记后蝌蚪胚胎分化的不同阶段Biomaterials 29 (2008) 41704176Biomaterials 29 (2008) 417041(5) 荧光分析新技术三维荧光分析法荧光偏振分析法时间分辨荧光分析法能量转移荧光分析法同步荧光分析法(5) 荧光分析新技术三维荧光分析法可获得三维光谱图的仪器：可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷)光光谱图VB1和VB2的三维荧光光谱可获得三维光谱图的仪器：可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的同步扫描技术：根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的 关系，同步扫描可分为固定波长差()和固定能量差及可 变波长三种；同步扫描技术可简

32、化光谱：谱带变 窄，减少光谱重叠，提高分辨率； 如 图合适的可减少光谱重叠：酪氨酸 和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射 光谱严重重叠，但 60nm 时，只显示色氨酸的特征光谱，实现 分别测定。同步扫描技术：根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的6.1 磷光分光光度计荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有 荧光发射的同时测量磷光。1. 光学系统与荧光分光光度计的区别光源样品池激发 单色器检测器数据处理 仪器控制发射单色器切光器（斩波器）荧光：10-8 sec磷光：10010-4 sec斩光片的作用是利 用其分子受激所产生的 荧光与磷光的寿命不同 获取磷光辐射。6.1 磷光分光光度

33、计荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行2. 磷光附件通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测 定低温磷光。2. 磷光附件6.2 磷光分析法的应用稠环芳烃分析采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环 芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表农药、生物碱、植物生长激素的分析烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析 检测限0.01 g/mL药物分析和临床分析见下表6.2 磷光分析法的应用稠环芳烃分析分子发光分析法分子发光分析法二 化学发光分析化学发光现象是化学反应的反应物或 生成物吸收了反应释放的化学能后所 产生的光辐射现象。根据化学发光反应 在某一时刻的发光 强度或发光总量来 确定反应中相

34、应组 分含量的分析方法 叫化学发光分析法。二 化学发光分析化学发光现象是化学反应的反应物或 生成物吸收1. 化学发光反应在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发， 从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A+ B=C+D*D* D + h能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当;E = 170 300 kJ/mol；位于可见光区；发光持续时间较长，反应持续进行.化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中， 称生物发光(bioluminescence)。1. 化学发光反应在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激分子发光分析法分

35、子发光分析法Sea Pansy Renilla luciferaseCORALS1cm1cm1cm 1mmSea Pansy Renilla luciferase2.化学发光效率ceem参加反应的分子数 发射光子的分子数CL参加反应分子数激发态分子数ce激发态分子数产生光子数ex化学效率：发光效率：时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：dtCLCL dcI(t ) dc/dt 分析物参加反应的速率2.化学发光效率ceem参加反应的分子数 发3.化学发光强度与化学发光分析的依据ttIcl Icl定量依据：在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(

36、S)，其与被测物浓度 成线性：dcclttclclA dt c0 dt0I(t)dt 在化学发光分析中，被分析物 相对于发光试剂小得多，对于 一级动力学反应：dc / dt KcK 为反应速率常数3.化学发光强度与化学发光分析的依据ttIcl Icl4.化学发光反应的类型直接化学发光反应间接化学发光反应(1)直接和间接化学发光反应CA + BC光基态激发态FF光C 的能量化学发光发生的反应过程4.化学发光反应的类型直接化学发光反应间接化学发光反应(1)例：N O+ O3N O2*+O2N O2+h=760 nm)可利用这些化学发光反应测定O3没食子酸 +O3A*+O2A*+罗丹明BA+罗丹明

37、B*罗丹明 B+h nm)例：N O+ O3N O2*+O2N O2+气相化学发光反应一氧化氮与O3的发光反应NO+O3 NO2*NO2* NO2 + h发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/mL氧原子与SO2、NO、CO的发光反应O3 O2 + O （1000 C石英管中进行）SO2+O + O SO2*+ O2SO2 * SO2*+ h最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/mL(2)气相化学发光和液相化学发光气相化学发光反应(2)气相化学发光和液相化学发光氧原子与NO的发光反应：O3 O2 + O （1000 C石英管中进行）NO+O NO2*NO2 * NO2+ h发射光谱范

38、围：4001400nm；灵敏度1ng/mL氧原子与CO的发光反应：CO+O CO2*CO2 * CO2+ h发射光谱范围：300500nm；灵敏度1ng/mL氧原子与NO的发光反应：O3 O2 + O （1000 C.乙烯与O3的发光反应乙烯与O3反应，生成激发态甲醛：最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1 ng/mL 1g/mLC.乙烯与O3的发光反应乙烯与O3反应，生成激发态甲醛：最2.2液相化学发光反应应用于液相化学发光的物质包括鲁米诺、光泽精 和洛粉碱。其中研究较多，在分析中应用最多的是鲁米诺a鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）化学发光反应效率：0.150.052.2液相

39、化学发光反应应用于液相化学发光的物质包括鲁米诺、鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：鲁米诺化学发光反应机理及应用该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现 象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、 V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等可检测低至 10-9 mol/L 的H2O2；间接测定某些生物试样氨基酸 +O2葡萄糖 +O2 + H2O酮酸 +NH3+ H2O2葡萄糖酸 +H2O2氨基酸氧化酶葡萄糖氧化酶通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。鲁米诺化学发光反应机理及应用

40、该发光反应速度慢，某些金属离子可b过氧化草酸酯化学发光体系化学发光反应效率：0.20 0.30b过氧化草酸酯化学发光体系化学发光反应效率：用于测定过氧化氢或稠环芳烃以及 单磺酰基或荧光素标记的化合物草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组 成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射 出不同颜色的光(冷光源)。用于测定过氧化氢或稠环芳烃以及 单磺酰基或荧光素标记的化合物应用研究：荧光棒及原理染料不同，荧光棒的颜色不同应用研究：荧光棒及原理染料不同，荧光棒的颜色不同其他常见发光试剂其他常见发光试剂3 生物发光体系应用实例1在pH 7

41、 8；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与 磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素 酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：ATP+ LH2 + E + Mg2+ AMP LH2 E + Mg ppi +2H+复合物与氧反应，产生化学发光：AMP LH2 E + O 2 氧化荧光素* +AMP+CO2 + H2O 氧化荧光素*氧化荧光素+ h最大发射波长562nm3 生物发光体系应用实例1应用实例 2胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 在细菌中的黄素酶作用下， 在氧化型黄素单核苷酸 (FMA)存在下，产生发光反应 ：NADH + FMA + H+ NADH脱氢

42、 酶NAD+ +FMNH2FMNH+RCHO + O黄素酶FMN + RCOOH + H O + h222最大发射波长495nm应用实例 2胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 在细菌中的黄素酶分子发光分析法分子发光分析法4电化学发光电化学发光：电解质溶液电解反应所产生的光发射。 应用：免疫分析和DNA分析应用实例：4电化学发光电化学发光：电解质溶液电解反应所产生的光发射。5 液相化学发光测量装置装置流程光检测器信号放大器显示与记录高压控制发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或 总发光量；试样量小，重复性差；流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室， 连续发光，测定光强度；试样量大；发光反应室5 液相化学发光测量装置装置流程光检测器信号放大器显示与记录流动注射技术传统分析方法的特点：化学反应达到化学平衡。根据化学计 量关系确定待测物含量。缺点：手续繁杂、速度慢、结果不准确RZuieka和Hansen提出的流动注射技术的特点： 不需要反应完全就进行检测，化学反应可在非平衡动 态条件下进，从而提高了分析速度。区别于其他分析技术的三个要素，试样的注入、高 度重现的时间控制和受控制的分散。方肇伦先生在1992年提出将该技术定义为“在热力 学非平衡条件下，在液流