化验技术协会第八期培训资料2

1、*化验技术术协会第第八期培培训资料料（微生物物检定工工）*无菌检查查法 无菌检检查是检检查要求求无菌的的药品、医疗器器具、原原料、辅辅料及要要求无菌菌的其他他物品是是否染有有活菌的的一种方方法。事事实上，若若供试品品符合无无菌检查查法的规规定，仅仅表明了了供试品品在该检检验条件件下未发发现细菌菌和真菌菌污染。 无菌检检查法有有薄膜过过滤法、直接接接种法两两种方式式。细菌菌培养温温度322.52.5，真菌菌培养温温度255.52.5。1无菌检检查的环环境无菌检查查的所有有操作均均需在严严格控制制微生物物污染的的环境下下进行，操操作环境境的无菌菌保证程程度将直接接影响无无菌检查查结果，为为了保证证

2、无菌检检查用洁洁净室(区)环环境的稳稳定性，确确保检查查结果的的可靠性性，对洁洁净室(区)的的环境质质量采取取合理的的控制措措施和评评价方法法是必要要的。无无菌检查查应在环环境洁净净度1000000级和局局部洁净净度1000级的的单向流流空气区区域内或或隔离系系统中进进行，其其全过程程必须严严格遵守守无菌操操作，防防止微生生物污染染。单向向流空气气区、工工作台面面及环境境应定期期按医医药工业业洁净室室(区)悬浮粒粒子、浮浮游菌和和沉降菌菌的测试试方法的的现行国国家标准准进行洁洁净度验验证。隔隔离系统统按相关关的要求求进行验验证，其其内部环环境的洁洁净度须须符合无无菌检查查的要求求。 无菌室室应

3、采光光良好、避免潮潮湿、远远离厕所所及污染染区。面面积一般般不超过过lOmm2，不小小于5mm2,高度不不超过22.4m。由12个缓缓冲间、操作间间组成(操作间间和缓冲冲间的门门不应直直对)，操操作间与与缓冲间间之间应应具备灭灭菌功能能的样品品传递箱箱。在缓缓冲间内内应有洗洗手盆、毛巾、无菌衣衣裤放置置架及挂挂钩、拖拖鞋等，不不应放置置培养箱箱和其他他杂物；无菌室室内应六六面光滑滑平整，能能耐受清清洗消毒毒。墙壁壁与地面面、天花花板连接接处应呈呈凹弧形形，无缝缝隙，不不留死角角。操作作间内不不应安装装下水道道。 无菌操操作室应应具有空空气除菌菌过滤的的单向流流空气装装置，操操作区洁洁净度110

4、0级级或放置置同等级级别的超净净工作台台，室内内温度控控制188266，相对对湿度44565。缓冲冲间及操操作室内内均应设置能达达到空气气消毒效效果的紫紫外灯或或其他适适宜的消消毒装置置，空气气洁净级级别不同同的相邻邻房间之之间的静静压差应应大于55Pa，洁洁净室(区)与与室外大大气的静静压差大大于lOOPa。无菌室室内的照照明灯应应嵌装在在天花板板内，室室内光照照应分布布均匀，光光照度不不低于3300llx。缓缓冲间和和操作间间所设置置的紫外外线杀菌菌灯(222.5Wm3)，应应定期检检查辐射射强度，要要求在操操作面上上达400Wcm-22。不符符合要求求的紫外外杀菌灯灯应及时时更换。 无菌

5、室室应每周周和每次次操作前前用0.1新新洁尔灭灭或2甲酚液液或其他他适宜消消毒液擦擦拭操作作台及可能能污染的的死角，开开启无菌菌空气过过滤器及及紫外灯灯杀菌11小时。在每次次操作完完毕，同同样用上述消毒毒溶液擦擦拭工作作台面，除除去室内内湿气，用用紫外灯灯杀菌半半小时。无菌室的的洁净度度检查无无菌室在在消毒处处理后，无无菌试验验前及操操作过程程中需检检查空气气中菌落落数，以以此来判判断无菌菌室是否否达到规规定的洁洁净度，常常有沉降降菌和浮浮游菌测测定方法法。沉降菌检检测方法法及标准准以无菌菌方式将将3个营营养琼脂脂平板带带入无菌菌操作室室，在操操作区台台面左、中、右右各放11个；打打开碟盖盖扣

6、置，平平板在空空气中暴暴露300分钟后后将碟盖盖盖好，置置3252.5培养448小时时，取出出检查，33个平板板上生长长的菌落落数平均均不超过过1个。浮游菌检检测方法法及标准准用专门门的采样样器，宜宜采用撞撞击法机机理的采采样器，一一般采用用狭缝式或离心心式采样样器，并并配有流流量计和和定时器器，严格格按仪器器说明书书的要求求操作并并定期校校验，采采样器和和培养皿皿进入被被测房间间前先用用消毒房房间的消消毒剂灭灭菌，使使用的培培养基为为营养琼琼脂培养养基或药药典认可可的其它它培养基基。使用用时，先先开动真真空泵抽抽气，时时间不少少于5分分钟，调调节流量量、转盘盘、转速速。关闭闭真空泵泵，放入入

7、培养皿皿，盖上上采样器器盖子后后调节缝缝隙高度度。置采采样口于于采样点点后，依依次开启启采样器器、真空空泵，转转动定时时器，根根据采样样量设定定采样时时间。全全部采样样结束后后，将培培养皿置置32.52.5培养448小时时，取出出检查，浮浮游菌落落数平均均不得过过5个m3。每批培养养基应选选定3只只培养皿皿做对照照培养。 无无菌操作作台面或或超净工工作台还还应定期期请有关关部门检检测其悬悬浮粒子子，应达达到lOOO级(一般用尘埃粒粒子计数数仪)检检测尘埃埃粒径0.5m的粒粒数不得得超过33.5个升，5m的粒粒数为00,空气气流速应应0.355mss，可根根据无菌菌状况必必要时置置换过滤滤器。2

8、 仪仪器及用用具 2.11 无无菌室内内应准备备好盛有有消毒用用5甲甲酚或其其他适宜宜消毒溶溶液的玻玻璃缸、乙醇灯灯、火柴、镊镊子、775乙乙醇棉、碘伏棉棉等。 恒温温培养箱箱及生化化培养箱箱。离心机、生物显显微镜、真空架架、高压压蒸汽灭灭菌器、标准ppH比色色器(00.02酚磺酞酞指示液和和溴麝香香草酚蓝蓝指示液液)、恒恒温烤箱箱、开放放或全封封闭过滤滤系统。2.4 玻璃璃器皿 试管管、量筒筒、三角角瓶、移移液管、刻度吸吸管(11、5、10mml)、注注射器(2、55、lOmll)、双双碟等，用用玻璃洗洗涤剂或或清洁液液浸泡，水水洗3次次。如使使用过程程中与细细菌接触触(已污污染)，应应先灭

9、菌菌倒出内内容物后后再清洗洗，晾干干。凡无无菌操作作过程中中所用的的器皿，都都应用牛牛皮纸包包扎严密密，灭菌菌。移液液管、刻刻度吸管管在管内内上端，塞塞少许原原棉，以以手感不不松不紧紧为宜，然然后放于于吸管筒筒内或牛牛皮纸袋袋内，封封严，灭灭菌待用用；试管管、离心心管、三三角瓶等等在管(瓶)口口塞上海海棉胶(或硅胶胶)专用用塞或纱纱布棉塞塞，塞子子应塞进进管口内内2/33处，用用牛皮纸纸将管口口(包括括塞子)包扎严严，灭菌菌待用；将注射射器、针针头(99号、111号、122号)配配对，检检查针头头是否畅畅通后，将将注射芯芯、管和和针头分分别放在在双层纱纱布(或或布)内内，包扎扎严密，置置带盖容

10、容器(瓷瓷盘或铝铝制饭盒盒)内，盖盖严，用用牛皮纸纸包扎后后，灭菌菌待用。长柄取取样匙，放放于不锈锈钢长筒筒内，盖盖严，干干热灭菌菌待用。手术镊镊、手术术剪洗净净、擦干干。用双双层纱布布将1把把剪刀与与1把镊镊子间隔隔包扎在在一起，放放于带盖盖的容器器（瓷盒盒或铝制制饭盒)内，盖盖严，用用牛皮纸纸包扎，灭灭菌(参参照附录录XV灭灭菌法)待用。高压蒸蒸汽灭菌菌的物品品取出时时切勿立立即置冷冷处，避避免因急急速冷却却，使灭灭菌物品品内蒸汽汽冷凝造造成负压压，易染染菌，取取出后应应置恒温温培养箱箱(或干干燥箱)中烘干干，待用用。2.5 无菌菌衣、裤裤、帽、口罩等等洗净晾晾干，配配套，用用牛皮纸纸包严

11、，灭灭菌待用用或用一一次性的无菌物物品代替替。 2.66除菌滤滤器及滤滤膜 有多种种开放式式及封闭闭式滤器器用于过过滤除菌菌。微孔孔滤膜直直径500mm、孔孔径约00.45m。新新购入封封闭式滤滤器或滤滤膜，需需进行孔孔径大小小的测试试，一般般有三种种方法，其中一种种方法即即可。气泡法 先将将滤膜浸浸入水中中，使完完全湿润润，然后后用镊子子夹住一一片滤膜膜放于气气泡点测测定装置置或滤膜膜孔径测测定仪上上，膜上上放一块块与滤膜膜大小相相同的尼尼龙筛网网，再加加上多孔孔板，将将螺旋固固定圈旋旋紧，在在多扎板板上加335mmm深的的水(注注意排除除气泡)关闭放放气阀，启启动空压压机或氮氮气瓶阀阀，使

12、压压力缓缓缓上升，注注意观察察水面上上产生第第一个气气泡时，记记录压力力表的压压力，气气泡点压压力不应应小于22.2kkg/ccm2(0.2MPPa)。水流量法法 将将滤膜装装于除菌菌滤器上上，开动动真空泵泵，压力力在7000mmmHg(93kkPa)下，抽抽滤已滤清的水水约5000mll，计算算出每llminn的滤速速。20005年年版中国国药典对对滤膜的的滤速未未明确规规定，而而USPP规定在在7000mmHHg(993kPPa)压压力下，滤滤膜直径径47mmm；流流速555755mlminn。细菌过滤滤法 常用的的细菌为为粘质沙沙雷氏菌菌，将该该菌的新新鲜营养养琼脂斜斜面培养养物，接接种

13、于营养肉汤汤培养基基中，332.52.5，培养养1820小小时，用用0.9无无菌氯化化钠溶液液稀释至至10-3 (约相当当于71055cfuum11)，取取此菌液液1mll加至550mll 0.9无无菌氯化化钠溶液液中，按按薄膜过过滤法过过滤，取取该滤液液5mll接种于于营养肉肉汤培养养基400ml中中，322.52.5培养244小时,应无菌菌生长。不符合合规定的的滤膜不不得使用用。3 菌菌种及菌菌液制备备菌种的传传代次数数不得超超过5代代(从菌菌种保藏藏中心获获得的冷冷冻干燥燥的菌种种为第00代；冷冷冻干燥燥的原始始菌种开开启后转转种，为为第一代代)。原始菌种种购到后后，应由由专人负负责，接

14、接收菌种种时应检检查安瓿瓿的数量量和菌种种的名称称及每一一支安瓿的完完整性。并在相相应的菌菌种接收收登记表表上记录录所有关关于菌种种的信息息。将安安瓿存于于-200，使用用时首先先需要复复活冻干干菌种(按菌种种保藏中中心提供供相关资资料操作作)，一一般包括括以下步步骤：冷冻菌种种的复活活 清清洁安瓿瓿(可用用75的酒精精或碘伏伏)后，用用砂轮在在安瓿上上部三分分之一处划痕，用用干燥的的无菌纱纱布包裹裹安瓿，将将安瓿掰掰开，用用一无菌菌吸管吸吸取适量量0.50.8ml的液体体培养基基(生孢孢梭菌用用液体硫硫乙醇酸酸盐培养养基；金金黄色葡葡萄球菌菌、大肠肠埃希菌菌、铜绿绿假单胞胞菌和枯枯草芽孢孢杆

15、菌用用营养肉肉汤；白白色念珠珠菌、黑黑曲霉菌菌用液体体真菌培培养基)滴加到到安瓿中中，轻轻轻旋转安安瓿并吹吹打，使使冻干菌菌种和液液体培养养基充分分混和并并完全溶溶解，再再将安瓿瓿内的菌菌悬液全全部吸出出，转移移至相应应的培养养基试管管中，根根据菌种种类型采采用适宜宜的培养养条件(细菌培培养温度度32.52.5，188244小时；真菌培培养温度度25.52.5，35天)下培养养，观察察培养基基是否浑浑浊，(如不浑浑浊，细细菌应延延长培养养时间至至7天以以上，真真菌应延延长培养养时间至至14天天以上，仍仍未浑浊浊，按相相关规定定灭菌处处理。)浑浊说说明菌种种复活生生长，在在应用前前，还应应确认菌

16、菌种的纯纯度和特特性。菌种确认认 用用无菌接接种环取取上述培培养物，在在相应的的培养基基平板上上划线分分离单个个菌落，适适宜条件下下培养。培养后后观察是是否具有有典型的的菌落形形态，然然后挑取取单一的的纯菌落落，进行行革兰染染色、镜镜检，观观察其染染色特性性及菌形形。并作作生化实实验或使使用菌种种鉴定系系统进一一步鉴定定该菌种种。对已已通过确确认鉴定定后的菌菌种可以以使用或或传代保保藏。菌种传代代保藏方方法很多多，各单单位可根根据情况况采用，但但无论应应用何种种方法，都都应对采采用的方法进行行验证，确确保在相相应保存存条件下下的菌种种不会变变异且性性能稳定定，同时时也应兼兼顾到方方法的经经济和

17、简简便。常常用的有有甘油冷冷冻管保保藏法、斜面低低温保藏藏法等，此此类方法法简单易易行。甘油冷冻冻管保藏藏法 将待保保藏菌接接种平板板或琼脂脂斜面，适适宜温度度下培养养适宜时时间后(细菌2448小小时的培培养物，白白色念珠珠菌722小时的的培养物物)，用用无菌接接种环轻轻轻刮取取菌苔，并并通过接接种环与与试管壁壁之间的的轻轻摩摩擦使细细菌充分分扩散到到预先装装于试管管中的无无菌蒸馏馏水中，调调整菌液液浓度，向向已制备备好的菌菌悬液中中加入等等体积、浓度为为20的无菌菌甘油，轻轻轻振摇摇小管，使使内容物物充分混混和，分分装于无无菌小管管，制好好的甘油油冷冻管管最好在在-300贮存。斜面低温温保藏

18、法法 将将工作用用菌种的的典型菌菌落接种种在适宜宜的固体体斜面培培养基，按按规定的的温度和时间间培养，待待菌生长长充分以以后，把把培养好好的新鲜鲜菌种管管用牛皮皮纸包好好，转移移至4左右冰冰箱保存存，如菌菌种保藏藏管的塞塞子是橡橡胶塞，并并采用半半固体高高层培养养基穿刺刺培养，则则可以保保存时间间较长。铜绿假假单胞菌菌不宜用用本法保保存。3.1 菌种种(1)金金黄色葡葡萄球菌菌(Sttaphhyloococccuaaureeus)CMMCC(B)2260003(2)枯枯草芽孢孢杆菌(Baccilllusssubttiliis)CMCCC(BB)6335011(3)大大肠埃希希菌(EEschhe

19、riichiiacooli)CMMCC(B)4441002(4)铜铜绿假单单胞菌(Pseeudoomonnasaaeruuginnosaa)CCMCCC(B)101104(5)生生孢梭菌菌(Cllosttriddiummspooroggenees)CMCCC(BB)6449411(6)白白色念珠珠菌(CCanddidaaalbbicaans)CMMCC(F)9980001(7)黑黑曲霉(Aspperggilllusnnigeer)CMCCC(FF)98800333.2 菌液液制备制备的菌菌液，一一般当日日使用。取金黄色色葡萄球球菌、枯枯草芽孢孢杆菌、大肠埃埃希菌、铜绿假假单胞菌菌的新鲜鲜培养物

20、物少许接接种至营养肉肉汤培养养基中，生生孢梭菌菌的新鲜鲜培养物物少许接接种至硫硫乙醇酸酸盐流体体培养基基中，332.52.55培养118224小时时；白色色念珠菌菌的新鲜鲜培养物物接种至至改良马马丁培养养基或改改良马丁丁琼脂培培养基中中，255.52.5培养224448小时时，上述述培养物物用0.9无无菌氯化化钠溶液液制成每每毫升含含菌小于于1000菌落形形成单位位(cffu)的的菌悬液液。将黑曲霉霉菌斜面面的新鲜鲜培养物物接种至至改良马马丁琼脂脂斜面培培养基上上，255.52.5培养57天天，使大大量的孢孢子成熟熟。加入入355ml 0.9无无菌氯化化钠溶液液，用玻玻棒或白白金饵轻轻轻振摇摇

21、将孢子子洗脱。然后，用用管口带带有能过过滤菌丝丝的装置置(如薄薄层无菌菌棉花或或纱布的的无菌毛毛细吸管管)的吸吸管吸出出胞子悬悬液至无无菌试管管内，用用0.9无无菌氯化化钠溶液液将其稀稀释至每每毫升含含小于1100ccfu的的孢子悬悬液(可可采用比比浊法)。以上菌液液在供试试验的同同时，金金黄色葡葡萄球菌菌、铜绿绿假单胞胞菌、大大肠埃希希菌、枯枯草芽孢孢杆菌用营养养琼脂，白白色念球球菌和黑黑曲霉用用改良马马丁培养养基注皿皿(1mm1)或或平板涂涂布(00.1m11)，按按规定条条件培养养后，计计数。4 培培养基4.1 一般采采用商品品脱水培培养基，临临用时按按照使用用说明书书进行配配制，配配制

22、培养养基时称称量要迅速以免免吸潮而而影响称称量的准准确性，同同时为避避免增加加培养基基中的金金属离子子及其他他微量化化学元素而影响响微生物物的生长长、鉴别别、所用用器具应应为洁净净玻璃器器皿，所所用溶解解用水为为纯水。4.2 培养养基的ppH值应应符合规规定，否否则必须须校正。调节ppH值：测定ppH值的的标准温温度为252，调节节pH值值可用无无菌的llmollL(1N)氢氧化化钠或110碳碳酸钠溶溶液、llmollL盐盐酸溶液液或155%冰醋醋酸溶液液。分装装好的培培养基及及时密封封后必须须在配制制当天(2小时时内最佳佳)进行行灭菌处处理。4.3 新鲜鲜配制的的培养基基，应按按中国药药典规

23、定定的处方方，对培培养基的的原材料料要进行行挑选，化化学药品品均需用用CP试试剂规格格。4.3.1 除除葡萄糖糖和指示示液外，将将处方中中各成分分加水后后置有石石棉网的的电炉、可调电电磁炉或或其它适宜宜的加热热设备中中，微温温溶解。用lmmol/L氢氧氧化钠溶溶液调节节pH，使使其比规规定的ppH值略略高0.40.66，煮沸沸，用棉棉(纸)浆减压压抽滤或或以脱脂脂棉，滤滤纸等滤滤材过滤滤，使培培养基澄澄清。4.3.2 加入葡葡萄糖和和指示液液，摇匀匀，补足足水量，调调节pHH值(比比规定的的pH值值略高00.20.4)，使灭灭菌后为为7.10.22，分装装，装量量不宜超超过容器器的23，以以免

24、灭菌菌时溢出出。4.3.3 硫乙醇醇酸盐流流体培养养基I，分分装至适适宜的容容器中，其其装量与与容器高高度的比比例应符合培养养结束后后培养基基的氧化化层(粉粉红色)不超过过培养基基深度的的122，灭菌菌。在供供试品接接种前，培培养基氧氧化层的的颜色不不得超过过培养基基深度的的l55，否则则，须经经1000水浴或或流通蒸蒸汽加热热至粉红红色消失失(不超超过200分钟)，迅速速冷却。培养基基只限加加热一次次，并防防止被污污染。4.3.4 灭菌应应采用验验证合格格的灭菌菌程序进进行。培培养基应应只能进进行一次次蒸汽灭灭菌处理理。固体培养养基使用用前的融融化，不不宜使用用蒸汽灭灭菌柜融融化琼脂脂培养基

25、基，宜选选用沸水水浴融化化培养基基。4.4 未开开封脱水水培养基基应避光光储存于于25以下阴阴凉干燥燥处，已已开封的的脱水培培养基应应盖紧，避光光储存于于25以下阴阴凉干燥燥处。制制备好的的培养基基应保存存在225避光的的环境，有有条件置置冰箱448冷藏储储存较好好。培养养基若保保存于非非密闭容容器中，应应在三周周内使用用；若保保存于密密闭容器器中，可可在一年年内使用用。 4.55 培培养基的的装量对于采用用直接接接种法检检查的液液体样品品，培养养基的装装量与供供试品的的装量相相关，供供试品的装装量小于于20mml的样样品，培培养基装装量155ml；供试品品的装量量大于或或等于220mll小于

26、550mll的样品品，培养养基装量量40mml；供试试品的装装量大于于或等于于50mml小于于1000ml的样品品，培养养基装量量80mml；4.5.2 对于采采用直接接接种法法检查的的固体样样品(含含药品及及外科用用辅料棉棉花及纱纱布)，培培养基的装量量均为1100mml；对对于缝合合线、一一次性医医用材料料及医疗疗器具，如如果医疗疗器具体体积过大大，培养养基的装装量可在在20000mll以上，以以将其完完全浸没没为准。4.5.3 对于采采用薄膜膜过滤法法检查的的样品，若若用封闭闭式薄膜膜滤器操操作的，培培养基装装量100mml；若若用开放放式薄膜膜滤器操操作的，培培养基装装量500ml。

27、4.6 培养养基的适适用性检检查培养基的的检查包包括无菌菌检查和和灵敏度度检查；符合规规定者方方可用于于供试品品的无菌菌检查。培养基的的无菌检检查可在在供试品品的无菌菌检查前前或与供供试品的的无菌检检查同时时进行，但但是所用用培养基不不符合无无菌要求求，供试试品的无无菌检查查结果应应视为无无效。培养基的的灵敏度度检查应应对购进进的每个个批号的的脱水培培养基进进行灵敏敏度检查查，检查查合格后后方可使用，但但当培养养基的配配制方法法和灭菌菌程序发发生变更更时，应应再次对对培养基基的灵敏敏度进行行检查。4.6.1 培养基基无菌检检查的操操作及结结果判定定每批培养养基随机机取不少少于5支支(瓶)，按规

28、规定温度度培养114天，应应无菌生生长。4.6.2 培养基基灵敏度度检查的的操作及及结果判判定取每管装装量为112mll的硫乙乙醇酸盐盐流体培培养基99支，分分别接种种金黄色色葡萄球球菌、铜铜绿假单胞菌、枯草芽芽孢杆菌菌、生孢孢梭菌各各2支，每每支接种种菌量为为lmll(含菌菌小于1100ccfu)，另11支不接接种作为为空白对对照，培培养3天天；取每每管装量量为9mml的改改良马丁丁培养基基5支，分分别接种种白色念念珠菌、黑曲霉霉各2支支，每支支接种菌菌量为llml(含菌小小于1000cffu)，另另1支不不接种作作为空白白对照，培培养5天天，逐日日观察结结果。空空白对照照管应无无菌生长长，

29、若加加菌的培培养基管管均生长长良好，判判该培养养基的灵灵敏度检检查符合合规定。对于配制制后的选选择性培培养基的的灵敏度度检查试试验同上上。5 方方法验证证试验为保证检检验质量量，对所所用的检检验方法法必须经经过验证证，才能能确保检检验结果果的准确确可靠。当建立药品品的无菌菌检查法法时，应应进行方方法的验验证，以以确认供供试品在在该实验验条件下下无抑菌菌活性或或其抑菌菌活性可可以忽略略不计。若供试试品的生生产工艺艺，原、辅料组组分或检检验条件件发生改改变时，检检查方法法应进行行重新验验证。针对药品品的无菌菌检查试试验，在在确定产产品的无无菌检查查试验方方法时或或建立新新的检查查方法时时，或当试验

30、验条件(包括培培养条件件)发生生变更时时，都必必须要对对新的或或变更后后的检验验方法加加以验证证，以确确认供试试品在该该实验条条件下无无抑菌活活性或其其抑菌活活性可以以忽略不不计。确确保在实实际检验验条件下下，该供供试品的的无菌检检查法的的准确性性、有效效性和重重现性。验证时时，按“供试品品的无菌菌检查”的规定定及下列列要求进进行操作作试验。供试品品对每一一试验菌菌的抑菌菌活性应应逐一进进行验证证。验证用菌菌种、菌菌液制备备、各试试验菌所所对应的的培养基基及培养养温度、参见33.1及33.2部分分。5.1 薄膜膜过滤法法验证试试验将规定量量的供试试品按薄薄膜过滤滤法过滤滤，冲洗洗，在最最后一次

31、次的冲洗洗液中加加入试验验菌少于于100CCFU。取出滤滤膜接种种至相应应的培养养基中，或或将培养养基直接接加至滤滤筒内。另取一一滤筒，不不过滤供供试品，其其它操作作同上，作作为阳性性对照，将将含培养养基的容容器按规规定温度度培养335天天。各试试验菌及及相应的的培养基基逐一进进行验证证。5.2 直接接接种法法验证试试验取适宜装装量的硫硫乙醇酸酸盐流体体培养基基8管，分分别加入入金黄色色葡萄球球菌、枯枯草芽孢孢杆菌、铜绿假单单胞菌、生孢梭梭菌的菌菌液各两两管；取取适宜装装量的改改良马丁丁培养基基4管，分分别加入入白色念念珠菌、黑曲霉霉菌菌液液各两管管。每管管加菌量量小于1100ccfu。其中1

32、1管接入入规定量量的供试试品，另另1管作作为阳性性对照，各各试验管管按相应应规定的的温度培培养35天。5.3 判断断与阳性对对照比较较，如含含供试品品各容器器中的试试验菌均均生长良良好，并并且与阳阳性对照照容器内内的培养结果果相似，则则供试品品的该检检验量在在该检验验条件下下无抑菌菌作用或或抑菌作作用消除除，供试试品可按按该法进进行无菌菌检查。若含供供试品的的任一容容器中微微生物生生长微弱弱、缓慢慢或不生生长，则则供试品品的该检检验量在在该检验验条件下下有抑菌菌作用，若若采用的的是直接接接种法法，可根根据实际际情况增增加培养养基的用用量、在在冲洗液液中或培培养基中中使用中中和剂(如-内酰酰胺酶

33、、对氨基基苯甲酸酸、聚山山梨脂880)、或改为为薄膜过过滤法。若采用用的是薄薄膜过滤滤法，可可采用增增加冲洗洗液的用用量、改改变冲洗洗液的种种类、更更换滤膜膜品种等等方法消消除供试试品的抑抑菌作用用。并重重新进行行验证试试验。 已进行行过无菌菌检查法法方法验验证试验验的供试试品，按按此法进进行无菌菌检查。 6 供供试品的的无菌检检查 6.11 检检验数量量及检验验量检验数量量是指一一次试验验所用供供试品最最小包装装的数量量。除另另有规定定外，出出厂产品品应尽量量抽取批批生产开开始和结结束或生生产过程程出现异异常情况况下的产产品进行行检验；一般情情况下，供供试品无无菌检查查若采用用薄膜过过滤，应

34、应增加11/2的的最小检检验数量量作阳性性对照用用；若采采用直接接接种法法，应增增加供试试品1支支(或瓶瓶)作阳阳性对照照用。检验量是是指一次次试验所所用的供供试品总总量(gg或ml)。采用用直接接接种法时时，若每每支(瓶瓶)供试试品的装装量按规规定足够够接种两两份培养养基，则则应分别别接种硫硫乙醇酸酸盐流体体培养基基和改良良马丁培培养基。采用薄薄膜过滤滤法时，检检验量应应不少于于直接接接种法的的总接种种量，只只要供试试品特性性允许，应应将所有有容器内内的全部部内容物物过滤。 6.22培养基基用量 除另另有规定定外，供供试品无无菌检查查时，每每支培养养基的实实际装量量及所占占容器高高度的比比例

35、应与与“验证试试验”所用的的培养基基相同。 6.33 阳阳性对照照 供试品品无菌检检查应进进行阳性性对照试试验。阳阳性对照照菌的选选择原则则：应根根据验证证试验结结果选择择相应对对照菌，阳阳性对照照管的加加菌量为为小于1100个个cfu。阳性对对照管培培养48872小小时，应应生长良良好。6.4 阴性对对照 凡无菌菌检查，均均应取相相应溶剂剂和稀释释剂同法法操作作作为阴性性对照。阴性对对照不得得有菌生生长。 6.5无菌菌检查操操作 无菌检检查法包包括薄膜膜过滤法法和直接接接种法法。只要要供试品品性状允允许，应应采用薄薄膜过滤滤法。 6.5.1 供试品品在移入入缓冲间间前应除除去外包包装、消消毒

36、外表表面并编编号，培培养基管管(瓶)用0.1%新洁尔尔灭或酒酒精棉擦擦拭瓶(管)外外壁，然然后连同同其他用用具(包包括无菌菌衣、帽帽、口罩罩等)移移入缓冲冲间，开开启操作作间紫外外灯和空空气过滤滤装置并并使其工工作1小小时以上上。 6.5.2 操作人人员用肥肥皂、水水清洗双双手，关关闭紫外外光灯，进进入缓冲冲间，换换拖鞋，再再用755乙醇醇棉球擦擦手，穿穿戴衣、帽、口口罩、手手套。将将所需物物品剥去去牛皮纸纸，移入入无菌间间，每次次试验中中所用物物品必须须计划好好，并有有备用物物。 6.5.3 供试品品外部消消毒 6.55.3.1 将消毒毒过的粉粉针剂、油剂等等铝盖压压封的橡橡皮塞小小瓶，先先

37、用755乙醇醇或碘伏伏棉球擦擦拭外壁壁及瓶塞塞，待干干，用灭灭菌镊子子剔去铝铝盖上的的铝质小小圆片，过过火焰数数次。将消毒过过的安瓿瓿针剂先先用碘酒酒棉球或或碘伏棉棉球将安安瓿外部部擦拭灭灭菌，待待干，用用砂轮或灭灭菌锉轻轻割安瓿瓿颈部（便便于折开开安瓿），再再用755%乙醇醇棉球将将磺酒擦擦净，待待干。6.5.3.33 其他他供试品品容器表表面或外外包装，可可参照上上述用适适当消毒毒液擦拭拭或浸没没后以无无菌的方方式取内内容物。6.5.4 供供试品制制备用灭菌镊镊取出注注射器，在在火焰旁旁将针芯芯插入针针管并安安上针头头，供试试品瓶盖盖和注射射器针头头均应迅迅速通过过火焰数数次；当当供试品品

38、为粉针针剂，瓶瓶盖为橡橡胶塞时时，用注注射器吸吸取规定定的溶剂剂，在已已消毒好好的橡胶胶塞中心心位置刺刺入小瓶瓶加入溶溶剂，溶溶解，混混匀后吸吸出溶液液，或选选用其它它适宜的的方法。如为注注射液、供角膜膜创伤及及手术用用的滴眼眼剂或灭灭菌溶液液可直接接用注射射器吸取取药液，或或选用其其它适宜宜的方法法。按规规定或需需灭活的的供试品品可用灭灭活剂溶溶解，将将瓶内供供试液抽抽出稀释释至规定定的浓度度。需加加入空气气加压后后便于抽抽出的供供试品，应应用注射射器对着着火焰抽抽取空气气加入，抽抽取瓶中中液体时时，应将将供试品品倒置并并使针头头在液面面下。供供试品如如为直接接分装成成注射用用无菌粉粉末的原

39、原料药（大大包装粉粉针剂），取取样时为为缩短暴暴露时间间，应由由两人操操作。将将放置于于缓冲间间的包装装瓶用00.1%新洁尔尔灭抹净净外壁，且且经紫外外线照射射1小时时后移入入操作间间（台），除除去铝盖盖，用775%乙乙醇棉或或碘伏棉棉球擦拭拭瓶口橡橡胶塞外外壁和瓶瓶口缝隙隙，待干干，戴好好医用消消毒手套套，在火火焰旁小小心揭开开瓶塞，用用专用取取样器取取出规定定量的样样品，置置灭菌试试管中，密密塞待用用，立即即盖好大大包装瓶瓶塞，用用橡皮胶胶布及时封封口，再再用封箱箱纸包扎扎瓶口。如果容容器内有有一定的的真空，可可用适当当的无菌菌器材（如如一端带带有除菌菌过滤器器的针头头），向向供试品品容器

40、内内导入无无菌空气气，再按按无菌操操作开启启容器取取出内容容物。供试品处处理时所所用的溶溶剂、乳乳化剂、分散剂剂、中和和剂及其其用量应应验证是有效效的，并并对微生生物生长长无影响响。除另有规规定外，供供试品处处理及接接种，按按下列方方法进行行。6.5.5 薄薄膜过滤滤法无菌检查查用的滤滤膜孔径径为不大大于0.45m，直径径约为550mmm。应根根据供试试品及其其溶剂的的特性选选择滤膜膜材质，如如抑菌性性供试品品采用低低吸附性性的滤膜膜，油性性供试品品选用疏疏水性滤滤膜。水水溶性供供试液过过滤前先先将少量量的冲洗洗液过滤滤以润湿湿滤膜。油类供供试品，其其滤膜和和过滤器器在使用用前应充充分干燥燥。

41、使用用时，应应保证滤滤膜在过过滤前后后的完整整性。同同时每片片滤膜的的总过滤滤量不宜宜太大，以以避免滤滤膜上的的微生物物受损伤伤。薄膜过滤滤法采用用封闭式式薄膜过过滤器或或开放式式薄膜过过滤器，可可优先选选用封闭闭式薄膜膜过滤器器。如采采用封闭闭式过滤滤器时，将将一次性性集菌培培养器（依依供试品品种类不不同选择择适宜的的集菌培培养器如如抗生素素类采用用抗生素素专用集集菌培养养器）放放于电控控集菌仪仪的排液液槽上，培培养器的的塑胶软软导管放放于电控控集菌仪仪的蠕动动泵的管管槽内，其其进液导导管的双双芯针头头，插入入供试液液或冲洗洗液等容容器的塞塞上。6.5.5.11 操操作打开待检检样品的的铝盖

42、，复复溶。吸吸取适量量药液加加入0.9%无无菌氯化化钠溶液液或其他他适宜的的溶液至至具塞的的瓶中，混混匀。如如采用封封闭式过过滤器，取取出培养养器先检检查包装装是否完完好无损损，将培培养器逐逐个插放放在不锈锈钢座上，将将培养器器的弹性性软管装装入集菌菌仪泵头头，注意意定位准准确，软软管走势势顺畅。将培养养器导管管上的针针头插至至供试液液容器塞塞上，开开动电控控集菌仪仪电源，将将样品瓶瓶倒置固固定于支支架上，使使药液均均匀通过过集菌培培养器，待待药液排排尽，关关闭电源源，将针针头取下下，插至至装有适适宜冲洗洗液的瓶瓶塞内，冲冲洗集菌菌培养器器的滤膜膜，照上上述操作作要求，冲冲洗次数数及冲洗洗量与验验证试验验保持一一致。滤滤干，关关闭电源源。将集集菌培养养器的排排气孔上上胶帽取取下，集集菌培养养器底部部的排液液管口拧拧上，将将冲洗瓶瓶取下换换上相应应的培养养基瓶，启启动电源源，将培培养基泵泵入指定定的培养养器内，关关闭电源源。用小小夹夹闭闭与培养养器连接接部的软