实验八凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾

1、实验八凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾 了解凝胶层析的原理及应用 通过血红蛋白脱盐实验，初步掌握凝胶层析技术实验目的 凝胶过滤层析： 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也称分子筛层析、排阻层析实验原理 单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。交联葡聚糖的凝胶颗粒分子筛效应： 大分子在前，小分子在后 高铁血红蛋白分子量大(MetHb，红褐色，Mw=64500)， 完全排阻Hb K3Fe(CN)6MetHb 高铁氰化钾分子量小(K3Fe(CN)6，黄色，Mw=327.25) ，可完全进入凝胶颗粒网孔内，从而达到分离的目的 交联葡聚糖高

2、铁血红蛋白与高铁氰化钾混合物高铁血红蛋白高铁氰化钾 利用特制的半透膜把大小分子分开的方法，截止分子量一般为一万临床应用：血液透析 透析液浓缩的蛋白混合样品透析袋开始透析处于平衡状态 透 析 法： 钼酸铵 + 氨基萘酚磺酸 + 磷酸盐钼蓝（蓝色） 15%三氯醋酸+蛋白质变性、沉淀实验器材与试剂 层析管、分液漏斗、吸管、透析袋、磁力搅拌器 血红蛋白溶液 交联葡聚糖G-25 0.4% K3Fe(CN)6 氨基萘酚磺酸试剂 钼酸铵试剂 15%三氯醋酸 0.1M磷酸缓冲液实验步骤 凝胶的处理G-25颗粒(5g)蒸馏水室温溶胀去除杂质10倍体积的蒸馏水浸泡(过夜) 装柱固定在铁架上加入缓冲液没过砂芯将凝胶

3、缓缓注入管内自然沉降至柱床高度达20cm以上 不可露出创面 盖滤纸层析管洗净、排出管中气泡关闭出口关闭出口打开出口装柱要求: 连续 均匀 无气泡 无分层 床面平整 层析柱稳定后接储液瓶，打开出口，用两倍于床体积的缓冲液洗脱平衡(5-10min )，不可露出床面，关闭出口 平衡 加样准备血红蛋白(3滴)与K3Fe(CN)6 (8滴)混合液自距床面1mm高处靠壁缓慢、均匀加入至液面降至与凝胶面相平放掉多余缓冲液至刚露出床面打开出口 洗脱与收集至洗脱液刚好流入床面再加洗脱液至3-4cm高连接储液瓶 调节活塞（1滴/5秒）进行洗脱缓慢加入样品量体积的洗脱液（不冲破胶面）打开出口关闭出口收集红褐色的Me

4、tHb色带带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图用洗耳球从层析柱下口慢慢将柱中的凝胶吹至小烧杯中回收 洗脱与收集将黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱后，用23倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶将MetHb洗脱液装入透析袋将透析袋口用止水夹密封 打开磁力搅拌器，透析30分钟 将透析袋悬入装有蒸馏水的烧杯中 透析 磷酸盐的鉴定试剂量钼酸铵试剂氨基萘酚磺酸试剂反应结果透析前杯内蒸馏水15滴2滴3滴？透析后杯内蒸馏水10滴2滴3滴？ 鉴定 蛋白质的鉴定试液量15%三氯醋酸反应结果透析前杯内蒸馏水40滴20滴？透析后杯内蒸馏水40滴20滴？透析袋内溶液1

5、0滴5滴？ 装柱后检查凝胶是否均匀，若有气泡或分层时，加入缓冲液搅动后静置或者重新装柱，保持柱床面平整； 洗脱时流速不可太快或太慢； 透析袋中的液体不可装满，否则会将透析袋胀破。注意事项 磷酸盐的鉴定试剂量钼酸铵试剂氨基萘酚磺酸试剂反应结果透析前杯内蒸馏水15滴2滴3滴透析后杯内蒸馏水10滴2滴3滴无蓝色实验结果 蛋白质的鉴定试液量15%三氯醋酸反应结果透析前杯内蒸馏水40滴20滴透析后杯内蒸馏水40滴20滴透析袋内溶液10滴5滴无无有沉淀 MetHb的相对分子量较大，直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，流程较短，移动速度快，首先流出 K3Fe(CN)6的相对分子质量较小，直径小于凝胶网孔可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中流程较长，移动速度慢，最后流出 磷酸盐是小分子，小于透析袋孔径的小，能够穿过透析袋；而蛋白质是大分子，不能透过透析袋，只能保留在袋中向凝胶柱中加入样品时，为什么必须保持胶面平整？上样体积为什么不能太大？请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快或太慢？圆盘电泳的