复旦大学生物化学分子生物学部分课件-RNA代谢

1、RNA metabolismCentral dogma by F. CrickDNA1957TranscriptionRNATranslationProteinDNA1970Reverse transcriptionProteinRNA转 录TranscriptionFrom DNA to RNA转录以DNA为模板，按碱基配对原则（dA-U、dT-A、dG-C、dC-G)合成RNA链。1. 都是酶促的核苷酸聚合过程； 2. 都需依赖DNA的聚合酶； 3. 模板均为DNA； 4. 延长机理都是形成磷酸二酯键； 5. 方向均为53; 6. 都遵从碱基配对规律但转录忠实性要低于DNA复制; 7. 转

2、录与复制都受到严格的调控。转录与复制的相似点复制转录模板DNA双链DNA的一条链原料dNTP (N=A、G、C、T)NTP(N=A、G、C、U)引物需要不需要酶DNA聚合酶RNA聚合酶产物DNARNA配对A-T、G-CA-U、T-A、G-C进程可一段一段复制中途不停止转录与复制的不同点 RNA的合成称为转录(transcription)，是以DNA为模板由RNA聚合酶催化的反应, RNA的延伸方向为53. NTP(NMP)n RNA聚合酶 (NMP)n+1 + PPi RNA 延伸了的RNA 1961年S. Spiegelman用分子杂交方法证明了DNA 与RNA之间的对应关系 原料: NTP

3、（ATP, UTP, GTP, CTP） 模板: DNA酶: RNA聚合酶（RNA polymerase, RNA-pol）其他蛋白质因子RNA transcription in E coli Definition of template strand RNA polymerase of E coli DNA sequence of a promoter Binding of RNA polymerase to a promoter: experimental evidence Start of transcription Termination of transcriptionE.Coli

4、RNA聚合酶是由五种亚基组成（ 2 ( )，MW 48000）。 亚基加上核心酶(2)称为全酶（holoenzyme)。亚基分子量功 能36512决定哪些基因被转录150618催化功能155613结合DNA模板70263辨认起始点9000未知，酶制剂有，全酶中无RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合 RNA聚合酶Structure & function of E coli RNA polymerase启动子识别,有多种类型,延伸时脱落功能未知酶活性中心由这两个亚基形成与调控序列结合不同亚基可以辨别不同的启动子，具有调控不同基因转录起始的作用，以适应环境变化及生物生长发育不同阶段的需求。利福霉素结合

5、到亚基导致酶失活，放线菌素D插入到双链DNA而阻止RNA聚合酶的移动精确性104-105其他原核生物的RNA聚合酶，在结构、组成、功能上均与E.coli相似。原核生物的 RNA聚合酶都受一类抗结核药利福平或利福霉素的特异性抑制。这类药物能与RNA聚合酶的亚基特异结合，从而影响酶的活性。大肠杆菌中的RNA聚合酶转录RNATemplate strand vs nontemplate strand在病毒中两条链可以同时成为模板链，但密码不同的蛋白质 双链DNA分子中能作为模板转录出RNA的那条链，称为模板链。又叫有意义链（sense strand）或Watson链。另一条互补链称为编码链，又叫反义链

6、（antisense strand）或 Crick链。与转录起始有关的DNA结构启动子 (Promoter)RNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子。10区，保守序列为 TATAAT-Pribnow 框（pribnow box, TATA框），是RNA聚合酶的牢固结合位点，简称结合位点。的存在保证原核生物RNA聚合酶只能与启动子区而不是其它区域形成稳定的二元复合物。细菌中常见两种启动子突变： -启动子上升突变，提高转录活性； -启动子下降突变，降低转录水平。由含70RNA多聚酶全酶识别的典型大肠杆菌启动子Pribnow boxPribnow boxSextama 框：35区，保守序列为TT

7、GACA-Sextama 框，是RNA聚合酶中 的识别位点，也是RNA聚合酶的初始结合位点。Pribnow框与Sextama 框之间的碱基序列并不重要，但两个序列之间的距离十分重要；天然启动子这段距离多为1520bp，距离的大小可能是决定启动子强度的因素之一。 实验表明：两个序列之间的距离为17bp时， 转录效率最高。足迹法原理(Footprinting)利用足迹法确定 RNA 聚合酶结合位点的实验大肠杆菌RNA聚合酶的转录起始RNA起始核苷酸为pppG或pppA终止子结构提供转录终止信号的序列-终止子（terminator），终止信号存在于RNA聚合酶已经转录过的序列之中。原核生物终止子分为

8、两类： 一类是不依赖于因子的转录终止； 一类是依赖因子的转录终止；两类终止子有共同的序列特征： 在转录终止点之前有一段间断的回文结构。两类终止子碱基组成的不同点： 不依赖因子 回文结构富含G-C 下游富含A-T 依赖因子 G-C含量较少 下游无特征终止子(terminator)结构依赖Rho因子的转录终止因子非依赖型转录终止原核生物转录的起始转录起始需解决两个问题：RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。 转录起始过程1. 因子辨认转录起始点（-35区的TTGACA序列）2. RNA聚合酶全酶(2)与模板35序列结合，形成闭合的二元闭合启动

9、子复合物。3. RNA聚合酶向10区转移，并与之牢固结合。4. 10区DNA双链解开1217bp，形成开放的二元启动子复合物（模板酶）。 5. 在RNA聚合酶亚基催化下形成第一个磷酸二酯键，形成三元复合物（模板酶RNA）。 5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppiRNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3转录起始复合物: RNA聚合酶有两个核苷酸结合位点：一个是起始核苷酸位点、一个是延长核苷酸位点。一般只有嘌呤核苷酸填充了起始位点，才能形成第一个磷酸二酯键。6. 当三元复合物中RNA长69个核苷酸时，因子 从全酶解离下来，进入延长阶段。原

10、核生物转录的延长1. 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；2. 在核心酶作用下NTP不断聚合，RNA链不断延长。3. 碱基配对原则：A-U，T-A，G-C4. 延长中的转录复合物也叫转录空泡。随着RNA聚合酶前移，转录产物RNA不断移出转录空泡，已转录完毕的DNA双链又重新复合而不再打开。5. 原核生物的转录和翻译偶联进行。(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi转录空泡(transcription bubble)：RNA-pol （核心酶） DNA RNA原核生物转录的终止和新生RNA链的释放RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进

11、，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。 分类依赖因子的转录终止非依赖因子的转录终止RNA transcription in eukaryotic cells Three types of RNA polymerases Promoter of RNA polymerase II Multiple proteins involved in RNA transcription by RNA polymerase II Start of transcription by polymerase II Promoter of 5S rRNA gene is located inside the ge

12、nepost-transcriptional RNA processing真核细胞三种RNA聚合酶的分工不同RNA polymerase I：转录rRNA 前体RNA polymerase II：转录mRNARNA polymerase III：转录tRNA, 5SrRNA蝇蕈素核仁核质Small nuclear RNA真核细胞的三种RNA聚合酶酶位置产物活性比较对-鹅膏蕈碱的敏感性RNA聚合酶核仁rRNA50-70%不敏感RNA聚合酶核浆hnRNA20-40%敏感RNA聚合酶核浆小RNA10%有种属特异性真核细胞的三种RNA聚合酶放线菌素D和吖啶的抑制机制Amanitin作用在II和III型

13、RNA聚合酶上只抑制原核生物某些常用的转录抑制剂抑制剂靶酶抑制作用利福霉素细菌的全酶与亚基结合，阻止起始链霉溶菌素细菌的核心酶与亚基结合，阻止延长放线菌素D真核RNA聚合酶与DNA结合，并阻止延长-鹅膏蕈碱真核RNA聚合酶与RNA聚合酶结合一些常用的转录抑制剂真核生物的启动子真核生物的三种RNA聚合酶，每一种都有自己的启动子类型。RNA聚合酶的启动子即 rRNA 基因的启动子，称类启动子。类启动子分两部分： -40 +5 称为近启动子，决定转录起始的位点； -165-40 称为远启动子，影响转录的频率。RNA聚合酶的启动子即 mRNA基因的启动子，称类启动子1、帽子位点（cap site）：即

14、转录起始位点，其碱基大多为 A 。2、TATA 框：又称Hogness 框，由含有TATA 的67个核苷酸组成，保守序列为 TATA（A/T）A（A/T） 。但TATA框的两侧富含G-C碱基对。TATA 框位于25 -30附近，是解链位置，决定转录起始位点。其序列的完整与准确对维持启动子的功能是必需的。3、CAAT 框：与RNA聚合酶的结合有关 位于 75 附近，保守序列为 GGNCAATCT。头两个 G 非常重要，一但突变，转录效率大大下降。CAAT 框控制着转录起始的频率。4、GC 框：某些转录因子可结合 位于110附近，以5 CCGCC 3序列为特征。CAAT和GC框为上游因子，对转录起

15、始频率有较大影响。5、增强子（enhancer）及作用特点： 能结合反式作用因子，决定基因的时间和空间特异性表达，增强启动子转录活性的DNA序列。 增强效应明显：使转录频率增加百倍或千倍。 增强效应与其所处的位置和取向无关：增强子以53或 35排列对启动子都有作用。 多为重复序列：约50bp，适合与反式因子结合，内部常有一个核心序列，为增强效应所必需。 增强效应具有严密的组织和细胞特异性。 没有基因专一性。 许多增强子受外部信号的调控。 RNA聚合酶 II 的启动子序列特征转录起始位点没有广泛的序列同源性，但第一个碱基为腺嘌呤，而两侧是嘧啶碱基。这个区域被称为起始子（initiator， In

16、r），序列可表示为Py2CAPy5。Inr元件位于-3+5。仅由Inr元件组成的启动子是具有可被RNA聚合酶II识别的最简单启动子形式。多数II类启动子有一个被称为TATA盒的共有序列，通常处于-30区，相对于转录起始位点的位置比较固定。 也有一些II类启动子不含有TATA盒，这样的启动子称为无TATA盒启动子。 RNA聚合酶II启动子上发生的事件RNA聚合酶 的启动子即 tRNA基因的启动子，称类启动子。类启动子位于转录起始点下游，称下游启动子或内部启动子。类启动子包括：A盒、B盒。A盒靠近5方向； B盒 靠近3 方向 。类启动子需要的转录因子包括： TF C、TF B、TF A，前两者是共

17、同的，后者为5S rRNA基因转录所需。RNA聚合酶III识别的启动子在基因内 爪蟾5S rRNA基因启动子的定位实验分析 原核生物 真核生物帽子结构 没有 有 起始核苷酸 嘌呤或嘧啶 嘌呤（A为主）启动区范围 较小(170) 较大 (1110) 上游序列 TTGACA CAAT、GC、增强子真核生物和原核生物转录起始位点的结构差异原核生物与真核生物启动子比较真核生物转录的起始真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化。转录起始时，RNA-pol不直接结合模板，而需依靠众多的转录因子，与模板结合形成转录起始前复合物，其起始过程比原核生物复杂得多。TATA box：启动子核心序列，-25bp区段

18、。CAAT 盒GC 盒增强子顺式作用元件（cis-acting element)转录起始前的上游区段 参与RNA-pol转录的TF TF: transcription factor, I、II、III三类-TF I、TF II和TF III。真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。RNA-pol前移处处都遇上核小体。转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。转录延长转录延长中的核小体移位转录终止1、RNA聚合酶转录出rRNA前体3末端后，继续向下游转录超过1000个bp时，存在一个18bp的终止序列。2、RNA聚合酶 转录模板的下游存在一个 终止子

19、，是位于GC丰富序列之中的TTTT。 RNA聚合酶有内原性的转录终止功能。3、RNA聚合酶的转录没有明确的终止信号。RNA pol 一种 高度分工起始转录因子 没有 需要（各不同）延长核小体影响 没有 有启动子以外序列 没有 有且复杂转录产物 多顺反子 单顺反子场 所 转录与翻译偶联 不偶联 转录终止 两种终止子 不明确 原核生物 真核生物 原核生物与真核生物转录的区别 RNA生物合成抑制剂概念：能阻断、抑制或者干扰核酸的代谢过程，最终抑制转录的一类化合物，称RNA生物合成抑制剂。分三类：1、嘌呤和嘧啶类似物，抑制核酸前体的合成；2、通过与DNA结合而改变模板的功能；3、与RNA聚合酶结合而影

20、响其活力。1、利福霉素及利福平，特异地抑制细菌RNA聚合酶的活性，因而抑制细菌RNA的合成。利福霉素可与RNA聚合酶的亚基结合，并阻止起始位点的填充，利福平则阻止RNA聚合酶的移动。2、利迪链菌素，与细菌的RNA聚合酶亚基结合，抑制转录过程中RNA链的延长反应。 3、-鹅膏蕈碱 ，抑制真核生物的RNA聚合酶，且RNA pol II极为敏感。对细菌RNA聚合酶作用极弱。转录后加工Post-transcriptional processing 许多细菌的RNA分子和几乎所有的真核生物的RNA，在它们被合成后都要受到各种各样的修饰，称为后加工(pro-cessing), 一个新合成的RNA分子称为p

21、rimary transcript, 或precursor. 受到加工最多的是真核生物的mRNA，其次为rRNA和tRNA。RNA加工机制的研究发现，反应的活性成分竟是RNA分子，蛋白质只起辅助作用，这就为我们在思考RNA分子的功能甚至生命的起源引入了一场革命。内含子归巢（Intron homing)I类II类的某些内含子中含有开放续框，可产生具有三种功能的蛋白。这些蛋白可使内含子（或以其原来的DNA形式，或作为RNA的DNA拷贝）移动（mobile），使内含子可插到一个新的靶位点，这个现象叫做归巢（homing）I组和II组内含子分布很广，在真核和原核细胞中都有发现。 在这些内含子的开放续框

22、中编码具有三种功能的蛋白，这些蛋白与DNA或RNA的代谢有关。（1）核酸内切酶：在DNA的靶位点剪切，使内含子得以插入；（2）反转录酶：涉及将内含子RNA变成DNA拷贝；（3）成熟酶：从前体的RNA中切掉内含子的部分。 Post-transcriptional processing of eukaryotic messenger RNA真核生物基因的惊人之处内含子的切除（Splicing）5 帽子的形成3 polyA tail的添加总结同一mRNA前体可以有不同的产物 对基因组DNA和从mRNA反转录得到的cDNA的序列测定得知，真核生物基因是断裂式基因(split gene)，由外显子(ex

23、on)与内含子(intron; 或IVS, intervening sequence) 组成，只有外显子编码氨基酸序列。内含子在mRNA被合成出来后以一种被称为剪接(splicing)的方式得以除去。 1982年Cech等在四膜虫的rRNA发现具有自我剪接功能的RNA (ribosome，核酶)，这样的RNA归属I型和II型内含子剪接。 真核基因中的内含子属III型，其剪接需要 snRNP (small nuclear Ribonucleoprotein)的帮助，剪接反应在剪接体 (spliceosome)中进行。不同剪接模式使单个基因产生不同功能的蛋白质，而异常剪接有时会引起疾病 ，如-地中

24、海贫血等。 IV型内含子的剪接反应需要ATP和核酸内切酶，出现在tRNA的加工中, 由Altman等1983年发现。真核生物mRNA内含子（Group III）的剪接过程。snRNP为RNAprotein复合物，每种snRNP含有一种长度为100到200个核苷酸的snRNA。 snRNP中的RNA与mRNA前体 （precursor）的配对过程。 Cech等人在1982年发现的Group I 内含子的剪接过程。反应第一步，转酯反应Group II的内含子剪接过程。与 Group I 不同之处在第一步的转酯反应，形成的产物成环形，与III型相似。Group IV内含子的剪接过程。反应需要ATP和

25、内切酶，最后还需要进行连接。三类内含子剪接机制的比较真核生物的mRNA多数接受5加帽修饰5帽子结构加帽过程真核生物的mRNA多数接受3多聚腺苷酸加尾修饰n =80-250总结：真核生物mRNA的转录和后加工 真核生物的mRNA前体由RNA聚合酶II识别真核基因启动子（比较典型的是TATA box）后进行转录，绝大部分mRNA在刚开始合成不久其5碱基就受到加帽修饰（共四种不同的帽子结构）；当mRNA前体延伸到适当程度后，内含子开始通过剪接机制得到去除，这个过程延续得比较长；当mRNA的前体全部合成后，其3端一般会有核酸酶识别AAUAAA的位点并将该位点后面10-30个核苷酸后面的片段切除，由po

26、lyadenylate polymerase加上一段80-250个A，称为poly(A) tail。为什么要5加帽和3加尾并不是很清楚，而为什么有内含子就更让人深思了。真核基因转录后加工的概括卵清白蛋白基因mRNA的加工示意图两种产出不同成熟mRNA的加工示意图称为替代加工（alternative processing）不同转录本大鼠降钙素基因转录本（transcript）的替代加工Trans-splicing splicing between mRNA precursors of different genes剪接错误造成地中海贫血该点突变导致剪接错误，多了几个氨基酸顺式和反式剪接 内含子剪

27、接一般都是发生在同一基因内，切 除内含子，相邻的外显子彼此连接，这种剪 接称为顺式剪接（cis-splicing）。反式剪接（trans-splicing）则是指发生在不 同基因之间的外显子的剪接。 反式剪接发现于几种锥虫和线虫中。都是在 mRNA 5端存在前导序列，称剪接前导RNA （splicing leader RNA，sl RNA）。 sl RNA的反式剪接表现了核内剪接系统的进化。细菌中rRNA前体的后加工脊椎动物中rRNA前体的后加工原核和真核tRNA前体的加工原核tRNA没有该内含子tRNA加工的最后一步碱基修饰 如：A Am（1）甲基化（2）还原反应 如：U DHU （3）核苷

28、内的转位反应 如：U （4）脱氨反应 如：A I碱基修饰四膜虫I型内含子的二级结构黄色所标碱基部分为内含子阴影部分为活性所需 端粒酶 (telomerase)是一个很特殊的反转录酶，维系多细胞生物的细胞寿命。L-19IVS是第一个发现的具有“合成”其他RNA功能的RNA分子具有催化功能的RNA分子Hammerhead ribozymePart IIFrom RNA to DNA, RNA to RNA典型的反转录病毒只有三个基因，但有两个转录本，而翻译出来的蛋白质则有23倍的数量。反转录酶Rous sarcoma virus的基因组HIV(human immunodeficiency viru

29、s)的基因组致癌基因是如何跑到反转录病毒基因组里去的癌基因 oncogene根据RT的性质设计的抗爱滋病药物鸡尾酒疗法是合用RT和蛋白水解酶的抑制剂，几乎不会出现抗性 (10-13)。 许多转座子、反转录病毒和内含子（包括Alu重复序列），可能在进化上拥有相同的起源。转座子(transposon)与反转录病毒惊人相似酵母转座子果蝇转座子有的内含子中密码了帮助转座的内切酶 端粒酶 (telomerase)是一个很特殊的反转录酶，维系多细胞生物的细胞寿命。RNA-dependent RNA polymerase 许多大肠杆菌噬菌体，如f2, MS2, R17和Q均为RNA基因，它们的复制不经过DNA，因此是从RNA到RNA，由RNA-dependent RNA polymerase（或称replicase）催化。Replicase 不能以DNA为模板,也不能以宿主细胞的RNA为模板。RNA编辑RNA EditingRNA 编辑（editing）发生在mRNA水平上, 多数为插入碱基Part IIIRNA, Origin of LifeTraditional theory for the origin of biomolecules？多肽形成的两个不同理论闪电紫外线Miller等的多肽生成理论Matthews的多肽生成理论腺嘌啉可以由五个HCN分子得到核