发酵工程精品课件

1、发酵工程第1页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二第一节 工业发酵生产菌种一、工业发酵微生物及其代谢产物(一)微生物代谢产物的类型1初级代谢产物2次级代谢产物第2页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二初级代谢主要是指把营养物质转化为机体结构和生理活性物质以及提供能量的代谢作用。微生物通过初级代谢途径，产生微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物，这些产物称为初级代谢产物。 初级代谢产物包括分解或合成过程中的各种中间代谢物、前体物、高分子物质以及能量代谢和代谢调控中起作用的各种物质，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、多糖和核酸等。第3页，共60页，2022年，5月20日，4

2、点49分，星期二次级代谢是微生物在一定的生理阶段出现的一种特殊代谢类型，是某些微生物为了避免在代谢过程中某些代谢产物的积累造成的不利作用，而产生的一类有利于生存的代谢类型，次级代谢产物通常是在生长后期合成。次级代谢产物是通过次级代谢合成的产物，如抗生素、生物碱、色素、激素和毒素等。 第4页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二（二）工业发酵常见微生物及其代谢产物1、细菌及其代谢产物2、放线菌及其代谢产物3、霉菌及其代谢产物4、酵母及其代谢产物第5页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二二、工业发酵对生产菌种的一般要求原料廉价易得，代谢产物产量高。对培养条件(糖浓

3、度、温度、PH、溶解氧及渗透压等)要求不高，易于控制，酶活性高。特别是在华南地区建厂，夏季气温炎热，应选择耐高温的菌种。第6页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二所选菌株生长速度和产物生成速度应较快，发酵周期较短。根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变菌株、调节突变菌株或野生菌株。不易被噬菌体感染。不易变异退化。二、工业发酵对生产菌种的一般要求第7页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二三、工业发酵生产菌种来源1、自然选育（需要通过菌种改良即菌种选育才能得到符合工艺要求的菌种）。2、从菌种保藏机构获得。3、从生产过程中已有菌种中筛选发生正突变的优良菌种

4、。第8页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二第二节 生产菌种的选育一、自然选育二、诱变育种三、杂交育种四、基因工程育种第9页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二一、自然选育 在生产过程中，不经过人工诱变处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程，称为自然选育或自然分离。 第10页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二1、分离思路 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。第11页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二定方案：首先要查阅资料，了解所需菌

5、种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。发酵性能测定：进行生产性能测定。包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。2、新种分离与筛选的步骤第12页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二（一）含微生物样品的采集如何使样品中所含微生物的可能性大?采样时应注意的问题:土壤微生物的分布采土深度土壤植被情况采样季节土壤的酸碱度第13页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二对于分离筛选新

6、菌种，还存在另两个选择标准：土壤来源广泛。在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种。第14页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。第15页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二（二）富集培养由于采集样品中各种微生物数量有很大差异，若估计到要分离的菌种数量不多时，就要人为增加分

7、离的概率，增加该菌种的数量，称为富集培养。方法： 控制一定的养分，例如碳源的控制。 控制一定的培养条件。第16页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二（三）纯种分离划线分离法稀释分离法组织分离法第17页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二 在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名称。步骤十第18页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二第19页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二（四）生产能力的考察1、初筛以量为主初筛是从分离得到的大量菌种中将合成目的产物的菌种筛选出来的过程。2、复筛以质为主平板筛

8、选摇瓶发酵筛选第20页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二（五）微生物选择分离的原理和方法1、变色圈法2、透明圈法3、生长圈法4、抑菌圈法第21页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二1、变色圈法在底物平板上加入指示剂或显色剂，由于目的微生物分解底物或代谢产引起平板上出现变色圈，使所需微生物能够被快速鉴别出来。例如，筛选果胶酶产生菌时，用含02果胶为唯一碳源，待培养基平板菌落长成后加入02刚果红溶液染色4 h，具有分解果胶能力的菌落周围便出现绛红色水解圈。第22页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二3、生长圈法工具菌是一些营养缺陷型菌株。将待

9、检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少工具菌所需营养物的平板培养基上，进行培养，若某菌株能合成工具菌所需营养，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈。第23页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二细菌分离：以乳酸菌为例 取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中 加麦芽汁至瓶口处，封塞，25培养24-48h培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌 用选择性培养基分批富集培养2-3代稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基 根据透明圈挑选菌落 性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定） Rf值定性 （有机酸呈黄斑点） 乳酸生成量测定（滴定法

10、）第24页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二放线菌的分离：以产链霉素菌种的分离为例（从退化菌种中筛选） 取工业发酵液（含孢子）样品1环放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀采用稀释法制平板，获取单菌落 斜面保藏 高产菌恢复根据高产菌的特点，选择目的菌落 放大培养，发酵液性能测试筛选模型：形态依据第25页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例 取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7 稀释分离法 取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（2） 在麦芽汁固体培养基上，25培养48-72h 形态筛选 根据正常株特点进

11、行挑选，接种斜面备用 纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次 生成子囊孢子速度测定 发酵力测定 性能测定 热死温度测定 凝集力测定 双乙酰含量测定第26页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种.诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂。诱变剂物理：紫外，快中子化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍二、诱变育种第27页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二（二）诱变剂处理过程中几个有关的问题出发菌株的选择诱变剂的选择诱变剂量的选择单孢子（细胞）悬液的制备第28页，共60页，2022年，5月20日，4点4

12、9分，星期二出发菌株选好出发菌株对诱变效果有着极其重要的作用。有些微生物比较稳定，其遗传物质耐诱变剂的作用强。如果用这种菌株于生产是很有益的，而用作出发菌株则不适宜。用作诱变的出发菌株必须对它的产量、形态、生理等方面有相当了解。挑选出发菌株的标准是产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广，再确定诱变剂的使用及筛选条件。 第29页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二出发菌株的选择1自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。2在生产中经生产选种得到与野生型较相像的菌株，也是良好的出发菌株。3每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。4出发菌株

13、开始时可以同时选23株。5要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞。第30页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二诱变剂的选择根据经验或菌种的已有诱变背景选择诱变剂。同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞；有的作用于休止期，就可选用孢子。第31页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二几种物理、化学诱变剂的使用方法A 紫外线 紫外线是一种使用时间较久，廉价，危险性小，诱变效果好，故应用最广泛，研究得也最多。对诱变最有效的波长是260 nm左右（253265）nm。一般诱变时用菌（孢子）

14、悬浮液进行处理，紫外灯的功率为15W，距离固定在30 cm左右。紫外线的作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性，造成菌体死亡和变异。 第32页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二B 快中子中子是原子核的组成部分、是不带电荷的粒子，可由回旋加速器、静电加速器或原子反应堆产生。中子不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核射出质子来，因而快中子的生物学效应，几乎完全是由质子造成的。受中子照射的物质所射出的质子是不定向的，照射后产生的电离，则集中在受照射物体内沿着质子的轨迹上。中子分为快中子和慢中子。快中子的能量为0.210百万电子伏特，慢中子的能量为l40100电

15、子伏特。慢中子的效应同射线、射线和电子等照射时引起的基本相同，快中子较X射线、射线具有较大的电离密度因而能更多地引起点突变和染色体畸变。第33页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二剂量范围约为100-1500戈。快中子在诱变育种中有较好的效果，近年来国内已广泛应用。由于剂量测量还不统一，不同反应堆或其他中子源所放射的快中子能量亦不同。因此，诱变结果也很不一致，为此，国际原子能组织已提倡推广标准化的照射装置。第34页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二氮 芥氮芥为极易挥发的油状物，它的盐酸盐是白色粉末，一般使用的是其盐酸盐。应用时先使氮芥盐酸盐与碳酸氢钠其作用

16、，释放出氮芥子气，再与细胞起作用而造成变异。氮芥的诱变机制是它能引起染色体畸变。是被使用得最早的一种诱变剂。第35页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二亚硝酸常用的有效诱变剂，其诱变作用主要是脱去碱基中的氨基。 亚硝酸A H （次黄嘌呤）C UG X （黄嘌呤）亚硝酸很不稳定，容易分解成水和硝酸酐，硝酸酐继续分解放出NO和NO2。所以，可在临用前将亚硝酸钠放在pH4.5的醋酸缓冲液中，使先生成亚硝酸然后再使用。第36页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二亚硝基胍 (NTG)是亚硝基烷基类化合物，可诱发营养缺陷型突变，不经淘汰便可直接得到12%至80%的营养缺

17、陷型菌株，有超级诱变剂之称。在缓冲液中较难溶解，而在甲酰胺中溶解度较大，因此用甲酰胺溶解，可以提高处理浓度。通常在浓度为30ug/ml、温度为28C和时间为60min的条件下进行处理，容易得到高产菌株 。第37页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二剂量选择对一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降。目前一般用死亡率为70%-80%时的剂量。剂量似乎也不宜过低，因为在使用高剂量诱变时，除个别核被诱发变异外，还可以使其它的核破坏致死，最终能形成较纯的变异菌落；另外，高剂量可能引起遗传物质的巨大损伤，产生回复突变少，促使变

18、异后菌株的稳定。凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适剂量。第38页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二处理菌悬液的制备这一步骤的关键是制备单细胞和单孢子状态的、活力类似的菌悬液。 1）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂 2）可避免长出不纯的菌落。第39页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二处理前，细胞应尽可能达到同步生长状态。细胞菌龄一般在对数期。霉菌的菌丝一般是多核的，所以对霉菌的处理一般应采用孢子悬浮液。菌悬液浓度：真菌106 107个/mL，细菌放线菌108个/mL。第40页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二（

19、四）中间培养由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。中间培养对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。第41页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二方法： 让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。第42页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二（五）分离和筛选筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异. 例

20、如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质的作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。第43页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二 第 一 轮：1个出发菌株诱变处理200个单细胞菌株50 株5 株初筛每株1瓶复筛每株4瓶 第 二轮：5个出发菌株诱变处理40株40株40株40株40株50 株5 株初筛每株1瓶复筛每株4瓶第44页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二三、杂交育种杂交育种是指将两个基因型不同

21、的菌株经结合（或接合）或原生质体融合使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。第45页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二杂交育种的目的（1）通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株（重组体）；（2）可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷；（3）通过杂交，可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种； （4）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律，促进遗传学理论的发展。第46页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二原生质

22、体融合技术所谓原生质体融合就是把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹着的球状体（称原生质体）。 两亲本的原生质体在高渗条件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。在再生成细胞的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子。第47页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二 原生质体融合首先应用于动植物细胞，以后才应用于真菌、细菌和放线菌。由于该技术能大大提高重组频率，并扩大重组幅度，故越来越引起人们的注意，在微生物育种工作中，原生质体触合作为一种新的育种技术

23、具有很大潜力。 第48页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二四、基因工程育种目的基因获得表达载体构建基因的导入鉴 定核酸鉴定：PCR; Southern and Northern blot.蛋白鉴定：SDS; HPLC; Western blot.功能检测：机体生理生化功能、性状的改变。原核:包涵体,分泌型真核:穿梭质粒文库合成PCR基因组文库cDNA文库细菌：氯化钙；电穿孔;细胞：磷酸钙；脂质体；电穿孔；微注射；V动物：微注射；电穿孔；精子；ESC；RT-V载体质粒(plasmid)粘粒(cosmid)噬菌体( phage)第49页，共60页，2022年，5月20日，4点4

24、9分，星期二第三节 工业发酵生产菌种的保藏一、菌种保藏的原理1、菌种退化所谓菌种退化，是指优良菌种的群体中出现某些生理特征和形态特征逐渐减退或丧失，而表现为目的代谢产物合成能力下降的现象。 第50页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二造成菌种退化的原因：菌种的自发突变或回复突变，引起菌体本身的自我调节和DNA的修复。细胞质中控制产量的质粒脱落或核内DNA和质粒复制不一致，若核内DNA复制的速率超过质粒，经过多次传代繁殖，细胞中将出现不具有对产量起决定作用的质粒，造成菌种退化。基因突变是引起菌种退化的根本原因，而移接代数越多，发生突变的概率越高。不良的培养和保藏条件，容易诱发菌

25、种基因或表型的改变，或导致质粒脱落，导致菌种退化。第51页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二退化的防止减少传代次数良好的培养条件利用不同的细胞接种传代第52页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二2、复壮在菌种的生产性能尚未退化前就经常有意识地进行纯种分离与生产性能测定，以保证菌种生产性状的稳定，甚至有所提高。 在菌种已退化的情况下，采用单细胞菌株分离的措施，通过菌落和菌体的特征分析和性能测定，从中筛选出具有原来性状的菌株或性状更好的菌株。 第53页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二3、菌种保藏 目的：提高菌种存活率，减少菌种的变异，保持原来优良的生产性能。原理：根据菌种的生物生理、生化特点， 人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态，生长繁殖处于休眠状态，以减少菌种的变异。 保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体（孢子、芽孢等），其次是要创造一个最有利于休眠的环境，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，以达到降低其代谢活动，延长保存期的目的。第54页，共60页，2022年，5月20日，4点49分，星期二二、常用的保藏方法1、斜面低温保藏法2、液体石蜡覆盖保藏法3、砂土管保藏法4、悬液保藏法5、真空冷冻干燥保藏法6、低温保藏法7、液氮超低温保藏法第55页，共60页