食品微生物学检验致病菌的检验

1、食品微生物学检验致病菌检验食品药品检验所 第1页食品微生物学检验致病菌检验食品安全国家标准微生物常规检验技术致病菌的检验第2页食品安全国家标准GB 4789.1- 食品微生物学检验 总则GB 4789.2- 食品微生物学检验 菌落总数测定GB 4789.3- 食品微生物学检验 大肠菌群计数GB 4789.4- 食品微生物学检验 沙门氏菌检验GB 4789.5- 食品微生物学检验 志贺氏菌检验GB/T 4789.7- 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验GB 4789.10- 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验GB/T 4789.11- 食品微生物学检验 溶血性链球菌检验GB 4789.15-

2、食品微生物学检验 霉菌和酵母计数GB 4789.18- 食品微生物学检验 乳与乳制品检验GB 4789.30- 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特 氏菌检验GB 4789.35- 食品微生物学检验 乳酸菌检验GB/T 4789.36- 食品微生物学检验 大肠埃希菌O157： H7/NM检验GB 4789.40- 食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验第3页食品安全国家标准试验室环境应不影响检测结果准确性。试验室工作区域应与办公室区域显著分开。试验室工作区域面积和总体布局应能满足从事检测工作需求，试验室布局应采取单方向工作流程，防止交叉污染。试验室内温度、湿度、照度、噪声和洁净度等应符合工作要求。环

3、境： 第4页食品安全国家标准 普通样品检测应在洁净区域(包含超净工作台或洁净试验室)进行，洁净区域应有显著标示。 病原微生物分离判定工作应在二级生物安全试验室(Biosafety level 2 BSL-2) 进行(超净工作台不能替换生物安全柜)。环境： 第5页食品安全国家标准BSL2试验室第6页食品安全国家标准 参考菌株能够从国际菌种保藏中心如ATCC、国内具资质菌种保藏中心或室间质控活动中取得，准确判定过分离株也可使用。 试验室要准备好足够种类和数量参考菌株，满足培养基、试剂盒和试剂质量测试需要。菌种： 第7页食品安全国家标准第8页食品安全国家标准第9页食品安全国家标准第10页食品安全国家

4、标准第11页微生物常规检验技术平板划线分离： 第12页微生物常规检验技术形态结构观察： 染色特征 形状 大小 排列方式 细胞结构（包含细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、 芽孢等） 第13页微生物常规检验技术革兰氏染色： 1884年由丹麦病理学家C.Gram所创建。革兰染色法可将全部细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最惯用判别染色法。第14页微生物常规检验技术革兰氏染色： G-菌细胞壁中含有较多易被乙醇溶解类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁通透性，使初染结晶紫和碘复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经石炭酸复红复染后

5、就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，所以细菌仍保留初染时颜色。第15页微生物常规检验技术革兰氏染色：第16页微生物常规检验技术革兰氏染色：第17页微生物常规检验技术细菌运动性观察： 第18页微生物常规检验技术细菌运动性观察： 第19页微生物常规检验技术设计生化试验标准： 在试验中加入一些 化学物 质，使细菌代谢路径中分解代谢产物与加入化学物质发生反应，产生一些改变或出现某种特征。第20页微生物常规检验技术过氧化氢酶及过氧化物酶试验原理： 2H2O2 过氧化氢酶 2H2O+O2 过氧化物酶：RH2+H2O2 过氧化物酶

6、R+2H2O 阳性：细菌变为黑褐色，有气泡产生； 阴性： 不变色。阳性阳性阴性第21页微生物常规检验技术细胞色素氧化酶试验原理： 细胞色素C 细胞色素氧化酶 氧化型细胞色素C +对苯二胺 + -奈酚 靛酚兰（蓝色） 阳性： 2分钟内生成蓝色为阳性； 阴性：无改变。阳性阴性第22页微生物常规检验技术氰化钾试验： 阳性： 不抑菌，变混浊 阴性：抑菌第23页微生物常规检验技术硝酸盐还原试验原理： KNO3 还原酶 KNO2 KNO2+对氨基苯磺酸+ -萘胺 （立刻或数分钟内）红色化合物阳性阴性第24页微生物常规检验技术糖发酵试验：分解糖产酸，PH值下降，使培养基酸碱指示剂发生改变。 阳性：产酸产气阴

7、性阳性第25页微生物常规检验技术氧化发酵试验（O/F试验） ： 有些微生物分解葡萄糖必须有氧参加，此种细菌称为氧化型； 有些细菌有氧无氧均可分解葡萄糖，称发酵型； 有些细菌任何条件都不能分解葡萄糖，称产碱型。阴性灭菌琼脂（厌氧）第26页微生物常规检验技术甲基红试验（MR试验）原理 ：一些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可被深入分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培养基pH值下降到4.5以下，加入甲基红指示剂出现红色反应。第27页微生物常规检验技术V-P试验原理：一些细菌分解葡萄糖为丙酮酸，深入脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中氧氧化成二乙酰丁二酮，进而与培养基内蛋白胨中所含精

8、氨酸胍基发生反应生成红色化合物。阴性阳性第28页微生物常规检验技术柠檬酸盐试验（枸橼酸盐试验）原理： 一些微生物能够以铵盐作为唯一氮源，以柠檬酸盐作为唯一碳源，在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐生成碳酸盐，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色。阴性阳性第29页微生物常规检验技术丙二酸钠试验原理： 一些微生物能够以丙二酸钠作为唯一碳源，分解丙二酸钠生成碳酸钠，使培养基变成碱性，酸碱指示剂变色。阴性阳性第30页微生物常规检验技术马尿酸盐试验原理： 一些细菌能够水解马尿酸生成苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸和Fe3+反应生成有色苯甲酸盐沉淀。阳性第31页微生物常规检验技术明胶液化试验原理： 一些细菌可产生胞外酶

9、，使明胶蛋白分解为氨基酸,而失去明胶凝固能力。苯丙氨酸脱氨酶试验原理： 一些细菌有苯丙氨酸脱氨酶，能够使培养基中苯丙氨酸脱氨 生成苯丙酮酸，其与FeCl3反应产生蓝绿色 。阳性第32页微生物常规检验技术氨基酸脱羧酶试验原理： 一些细菌能够产生氨基酸脱羧酶使氨基酸脱酸，产生胺类物质，使培养基变碱，酸碱指示剂变色。阳性阴性第33页微生物常规检验技术脲酶试验原理： 一些细菌能产生脲酶（尿素酶），可催化尿素分解为氨和二氧化碳，使pH变高，培养基变为碱性，酚红指示剂变为红色。第34页微生物常规检验技术靛基质试验（吲哚试验）原理：一些细菌含有色氨酸酶，能够分解蛋白胨色氨酸，产生靛基质，靛基质可与对二甲氨基

10、苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而成红色。阳性阴性第35页微生物常规检验技术ONPG试验（ 检测-半乳糖苷酶）原理： 邻硝基苯-D-吡喃半乳糖苷 -半乳糖苷酶 邻硝基苯酚+ -D半乳糖阳性阴性第36页微生物常规检验技术淀粉酶试验原理： 一些细菌可产生淀粉酶将淀粉分解为双糖或单糖，加入碘不变色。接种菌，可产生淀粉酶第37页微生物常规检验技术卵磷脂酶试验原理：一些梭状芽孢杆菌产生卵磷脂酶，经钙离子作用，能分解卵黄或血清中卵磷脂产生混浊沉淀状甘油酯和水溶性磷酸胆碱，在菌落周围形成一个乳白色沉淀或浑浊带。乳白色浑浊带第38页微生物常规检验技术脱氢酶试验原理： 一些微生物有脱氢酶，可使氯化三苯四氮唑（TTC)还

11、原，由无色变为红色。阳性第39页微生物常规检验技术硫化氢试验原理： 一些微生物分解含硫氨基酸（胱氨酸或半胱氨酸），产生硫化氢与二价铁盐或铅盐生成黑色沉淀。阳性第40页微生物常规检验技术七叶苷水解试验原理： 一些细菌能分解七叶苷生成七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁二价铁离子发生反应，形成黑色化合物。第41页微生物常规检验技术石蕊牛奶试验原理：细菌对牛奶利用分为：产酸及酸凝固产碱胨化作用凝乳酶凝固石蕊还原 第42页微生物常规检验技术三糖铁试验（TSI）： 成份：牛肉膏、蛋白胨（氮源） 三糖：葡萄糖0.1%、乳糖1%、蔗糖1% 硫酸亚铁 琼脂 pH值调到7.4 培养基摆成高层斜面 黄 pH7接种：（

12、1）穿刺接种 （2）斜面划线接种 36oC培养18-二十四小时第43页三糖铁试验（TSI）：观察结果。（1）分解葡萄糖、乳糖、蔗糖：斜面产酸变为黄色（阳性），底层产酸变为黄色（阳性）。（2）分解乳糖、蔗糖，不分解葡萄糖：斜面、底层都产酸变为黄色（阳性）。 （3）分解葡萄糖、不分解乳糖、蔗糖： 斜面：产碱显红色 （阴性） 底层：产酸显黄色 （阳性）（4）分解含硫氨基酸 产硫化氢硫化氢与Fe2+生成黑色沉淀，培养基变黑（FeS）。（5）分解糖类产气，培养基中有气泡。微生物常规检验技术（1）（2）（3）第44页微生物常规检验技术血清学试验：抗原与抗体在体外发生特异性结合反应叫血清学试验。 抗原：能在

13、体内引发免疫反应物质 抗体：抗原刺激产生物质玻片凝集试验Ag+AbAg+生理盐水（对照）第45页微生物常规检验技术生化试验阳性对照菌株阴性对照菌株靛基质试验大肠埃希氏菌产气肠杆菌甲基红试验大肠埃希氏菌产气肠杆菌VP试验阴沟肠杆菌大肠埃希氏菌尿素酶分解试验奇异变形杆菌大肠埃希氏菌硫化氢产生试验普通变形杆菌宋内氏痢疾杆菌苯丙氨酸脱氨酶奇异变形杆菌大肠埃希氏菌丙二酸盐利用试验肺炎克雷伯菌或亚利桑那沙门氏菌大肠埃希氏菌第46页微生物常规检验技术生化试验阳性对照菌株阴性对照菌株赖氨酸脱羧酶鼠伤寒沙门氏菌或粘质沙雷氏菌普通变形杆菌鸟氨酸脱羧酶鼠伤寒沙门氏菌或奇异变形杆菌普通变形杆菌精氨酸双水解酶鼠伤寒沙门

14、氏菌或阴沟肠杆菌普通变形杆菌邻位硝基苯-D半乳糖苷大肠埃希氏菌奇异变形杆菌第47页微生物常规检验技术生化试验阳性对照菌株阴性对照菌株明胶液化试验铜绿假单胞菌硝酸盐阴性杆菌硝酸盐还原试验铜绿假单胞菌硝酸盐阴性杆菌凝固酶试验（兔血浆）金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌触酶试验金黄色葡萄球菌肺炎链球菌胆盐溶菌试验肺炎链球菌绿色链球菌七叶苷分解试验肠球菌溶血性链球菌6.5%氯化钠肉汤肠球菌溶血性链球菌第48页微生物常规检验技术生化试验阳性对照菌株阴性对照菌株氧化酶试验铜绿假单胞菌大肠埃希氏菌氰化钾抑制试验产气肠杆菌大肠埃希氏菌Dnase试验粘质沙雷氏菌阴沟肠杆菌杆菌肽试验A群链球菌B群链球菌第49页致病菌检验

15、沙门氏菌检验：沙门氏菌是与肠杆菌科中形态和培养特征，生化反应及抗原结构相同，被O1噬菌体裂解一群革兰氏阴性杆菌。广泛存在于自然环境中，经过沙门氏菌病患者或健康带菌人和动物排泄物污染环境和食品。 易于污染高危食物：畜禽肉类、蛋、奶及其制品。沙门菌在肉类中不分解蛋白质，不产生靛基质，所以当食品污染了沙门菌后，通常没有感官性状改变。第50页沙门氏菌检验第51页沙门氏菌检验菌体短杆状，革兰氏染色阴性，无芽孢。第52页沙门氏菌检验 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色, 菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色菌落, 周围培养基不变。BS培养基第53页沙门氏菌检验XLD平板科玛嘉沙门氏菌显色培养基

16、平板第54页沙门氏菌检验初筛微生物菌落颜色沙门氏菌紫色(直径约1mm)柠檬酸杆菌属蓝色(直径约1mm)变形杆菌无色或被抑制第55页沙门氏菌检验赖氨酸脱羧酶靛基质尿素分解氰化钾（KCN）甘露醇硫化氢产生山梨醇ONPG卫茅醇水扬苷丙二酸盐沙门氏菌A-F“O”多价血清凝集三糖铁分解葡萄糖产酸不产气，不发酵乳糖，产生硫化氢关键特征第56页沙门氏菌检验斜面红色，底面黄色制好培养基培养基全黄色斜面、底部黄色，并产生H2S斜面红色，底部黄色，产生H2S底面黄色，并产生CO2对照管TSI试验第57页沙门氏菌检验靛基质（吲哚）试验第58页沙门氏菌检验尿素酶试验第59页沙门氏菌检验ONPG试验左为阳性（黄） 右为

17、阴性第60页沙门氏菌检验 血清学分型判定：有条件可进行血清学分型判定。 依据生化试验和血清学分型判定结果，汇报检验结果。第61页志贺氏菌检验志贺氏菌检验： 需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37，最适pH为6.4-7.8。37培养18-二十四小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，能分解葡萄糖，产酸不产气。不发酵乳糖，靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生H2S。根据生化反应可进行初步分类。第62页志贺氏菌检验第63页志贺氏菌检验菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性，无芽孢志贺氏菌显色培养基第64页志贺氏菌检验葡萄糖半固

18、体黄色，无动力氧化酶葡萄糖铵5乳糖发酵西蒙氏柠檬酸盐七叶苷分解赖氨酸脱羧酶靛基质鸟氨酸脱羧酶甘露醇尿素酶棉子糖氰化钾生长甘油水杨苷分解志贺氏菌属四种多价血清凝集三糖铁分解葡萄糖产酸不产气，不发酵乳糖，不产生硫化氢关键特征第65页志贺氏菌检验葡萄糖+乳糖- 甘露醇- 痢疾志贺氏菌1、3、4、5、6、9、10型 痢疾志贺氏菌2、7、8型 福氏6型，鲍氏1、2、3、4、5、6、8、10、12、14型 福氏痢疾菌（1、2、3、4、5型）鲍氏5、7、9、11、13、15型靛基质- 乳糖+ 宋氏志贺氏菌 靛基质- 靛基质+ 靛基质- 靛基质+ 甘露醇+ 第66页志贺氏菌检验2志贺氏菌3沙门氏菌4大肠杆菌

19、三糖铁（TSI）琼脂试验第67页溶血性链球菌检验溶血性链球菌检验：链球菌科链球菌属，据溶血能力不一样分四种：甲型溶血性链球菌（-溶血性链球菌）、乙型溶血性链球菌（-溶血性链球菌）、丙型溶血性链球菌（-溶血性链球菌）、亚甲型溶血性链球菌（-溶血性链球菌）。 形态：本菌呈球形或卵圆形，直径0.51微米，链状排列，链长短不一，短者48个细胞组长，长者2030个，链长短常与细菌种类及生长环境相关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中呈短链，不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。 培养特征：兼性厌氧，营养要求高。第68页溶血性链球菌检验第69页溶血性链球菌检验溶血性链球菌第70页溶血性链球菌检验甲链乙链丙链血平板

20、第71页溶血性链球菌检验链激酶试验杆菌肽敏感试验溶血关键特征第72页溶血性链球菌检验凝固溶解链激酶敏感试验第73页溶血性链球菌检验杆菌肽敏感试验第74页金黄色葡萄球菌检验 金黄色葡萄球菌判定： 形态与染色：金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。经典金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8 mm左右，显微镜下排列成葡萄串状。革兰氏染色阳性。 金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37，最适生长pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，边缘整齐、表面光滑、湿润，直径普通为12 mm。血平板菌落周围形成透明溶血环。金黄色葡萄球菌有高度耐盐性，可在7.515%

21、NaCl肉汤中生长。第75页金黄色葡萄球菌检验第76页金黄色葡萄球菌检验 经典金黄色葡萄球菌在BP琼脂平板上为灰黑色菌落，其外围有一不透明圈。 本培养基用于直接判定金黄色葡萄球菌，假如在 18-24 小时没有出现经典菌落，需再培养18-24 小时。有时金黄色葡萄球菌不显灰黑色 ，但其外围有一不透明圈。 第77页金黄色葡萄球菌检验血浆凝固酶试验第78页副溶血性弧菌检验副溶血性弧菌检验： 形态与染色：革兰氏阴性，展现多形态，表现为杆状、棒状、弧状甚至球状、丝状等各种形态，无芽孢，有鞭毛。 培养特征：耗氧性强，在厌氧条件下生长迟缓，营养要求不高，在无盐培养基中不能生长，在含盐0.5%培养基中即可生长

22、，生长适宜盐浓度为3-3.5%。第79页副溶血性弧菌检验第80页副溶血性弧菌检验第81页副溶血性弧菌检验 副溶血弧菌菌落在TCBS培养基上呈圆形 , 边缘整齐、湿润、稍混浊、半透明，多数具尖心、斗笠状，蓝绿色菌落，直径 2-4mm 。 第82页副溶血性弧菌检验氧化酶+V-P动力+ONPG蔗糖（实际为）嗜盐性(NaCl%)葡萄糖+0%NaCl甘露醇+3%NaCl分解葡萄糖产气6%NaCl乳糖8%NaCl硫化氢10%NaCl赖氨酸脱羧酶关键特征第83页大肠肝菌O157：H7/NM检验大肠肝菌O157：H7/NM检验： 肠出血性大肠杆菌（EHEC）是能引发人出血性腹泻和肠炎一群大肠埃希氏菌。革兰氏染

23、色阴性，无芽胞，有鞭毛，动力试验呈阳性。其鞭毛抗原可丢失，动力试验阴性。以O157:H7血清型为代表菌株。 第84页大肠肝菌O157：H7/NM检验第85页大肠肝菌O157：H7/NM检验大肠肝菌O157：H7/NM检验： CT-SMAC（山梨醇麦康凯琼脂基础 ）显色培养基不发酵山梨醇菌落为圆形、光滑、较小无色菌落，中心展现较暗灰褐色；发酵山梨醇菌落为红色CHROMagarO157弧菌显色培养基圆形、较小菌落，中心呈淡紫色-紫红色，边缘为无色或浅灰色第86页大肠肝菌O157：H7/NM检验大肠肝菌O157：H7/NM检验： CHROMagarO157弧菌显色培养基O157第87页大肠肝菌O157：H7/NM检验CT-SMAC显色培养基第88页大肠肝菌O157：H7/NM检验山梨醇氧化酶MR-VPMR,VP纤维二糖发酵西蒙氏柠檬酸盐靛基质赖氨酸脱羧酶棉子糖发酵鸟氨酸脱羧酶MUG三糖铁产酸，不产生硫化氢关键特征第89页单核细胞增生李斯特氏菌检验单核细胞增生李斯特氏菌检