长期施肥对土壤微生物量的影响

1、长期施肥对土壤微生物量的影响试剂购买 序号试剂名称规格需要数量（单位：瓶）备注1牛肉膏500g/瓶1未特别注明，所用化学试剂均为分析纯2蛋白胨500g/瓶23琼脂500g/瓶44可溶性淀粉500g/瓶25葡萄糖500g/瓶26氯化钠500g/瓶17硝酸钾100g18磷酸氢二钾500g197水硫酸镁500g/瓶110硫酸亚铁500g/瓶111孟加拉红最小包装12链霉素25g/瓶1-213NaOH114HCl1注：链霉素替代品硫酸链霉素25g/瓶2庆大霉素仪器仪器名称规格数量仪器名称规格数量搪瓷杯1移液枪（枪头）1ml15玻棒3烧杯1000ml3500ml2量筒100ml3试管10ml7010ml

2、3培养皿200玻璃滴管1玻璃珠三角瓶100ml8漏斗(过滤、培养基)2牛角匙1天平1乳胶管1弹簧夹1称量纸若干精密PH试纸若干酒精灯1接种环3记号笔1棉花（橡皮塞）若干高压蒸汽锅1牛皮纸/棉纱线/纱布若干铁架台（环）1电磁炉（搅拌器）1震荡机1放大镜1培养箱1培养基及配置方法 牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用） 牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂1520g，水1000ml，pH7.07.2，121灭菌20min。 高氏（Gause）1号培养基（培养放线菌用） 可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 .7H2O 0.5g，FeSO4 0

3、.01g，琼脂20g，水 1000ml，pH7.27.4。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，溶化后，补足水分至1000ml。121灭菌20min。 马丁氏（Martin）琼脂培养基（分离真菌用） 葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO47H2O 0.5g，1/3000孟加拉红（rosebengal，玫瑰红水溶液）100ml，琼脂1520g，pH自然，蒸馏水800ml，121度灭菌30min。临用前加入0.03%链霉稀释液10ml，使每毫升培养基中含链霉素30g。 配制步骤1、称量按培养基配方比例依次准确地称取所需药品放入搪瓷

4、杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，其他的放在称量纸上称量。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。2、溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，在电炉或搅拌器上加热使其溶解。待药品完全溶解后，加入琼脂，直至琼脂完全溶化，补充水分到所需的总体积。3、调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，在用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH或1mol/L HCl，边加边搅拌，使其pH值达到要求。4、分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。(1)液体

5、分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。5、加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，（试管7个一组加牛皮纸，棉线包扎；三角烧瓶牛皮纸以活结包扎；摇瓶培养用八层纱布）用记号笔注明培养基名称、组别、日期。6、灭菌将上述培养基以0.103MPa，121.3， 20分钟高压蒸汽灭菌。7、搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。8、无菌检查将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌

6、是否彻底。简要步骤在烧杯内加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，用蜡笔在烧杯外作上记号后，放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂，不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.27.6,分装在各个试管里，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌：1.05千克每平方厘米、121摄氏度维持1530分钟。检测方法 土壤中放线菌的检测 1、 在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10

7、。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量) 2、 倒人45恒温水浴的灭菌高氏l号培养基，水平放置，凝固待用；分别无菌吸取各样品10-4、10-5、10-6、10-7稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每皿lml)，用玻璃涂布棒涂抹均匀，将平皿倒置于28恒温培养箱中培养。放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多 3、 培养48h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。 每克土壤中菌落形成单位同一稀释度3次重复的平均菌落数稀释倍数。 土壤中细菌的

8、检测 1、 在超净工作台中，无菌称取所取土样10 g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量) 分别无菌吸取各样品10-5、10-6、10-7、10-8稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每皿lml)，倒人45恒温水浴的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基，混匀。（稀释倍数是情况而定） 待培养基凝固后，将平皿倒置于37恒温培养箱中培养。 4、培养24h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的

9、菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。 每克土壤中菌落形成单位同一稀释度3次重复的平均菌落数稀释倍数。 土壤中真菌的检测 1、在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量) 2、分别无菌吸取各样品10-2、10-3、10-4、10-5稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每皿lml)，倒人45恒温水浴的灭菌马丁氏（Martin）琼脂培养基，混匀。（稀释倍数是情况而定） 3、待培养基凝固后，将平皿倒