薄层色谱和柱色谱分离制备

1、有机物的别离与剖析石化学院第四章 薄层色谱和柱色谱别离制备1903年俄国植物学家Tswett首次将碳酸钙粉末装入玻璃柱中作吸附剂，用石油醚作洗脱剂从植物叶子中别离三种颜色的6个色带；1931年德国化学家Kuhn用同样的方法从植物中别离出-、-和-胡萝卜素及其它60种色素。色谱法的原理；利用不同的物质在两相一是固定不动的固定相，另一个是流动着的移动相中不同的平衡分配或吸附系数来进行的一种别离方法。 色谱法按流动相状态不同分为：气相色谱用气体作为流动相液相色谱用液体作为流动相柱色谱柱色谱由于分离量较大，主要应用于有机物的纯化别离薄层色谱薄层色谱主要应用于有机物的定性或定量分析色谱法按流动相状态不同

2、，可分为气相色谱和液相色谱两类。将液相色谱原理和方法用于制备别离有机物，如果这一操作在柱上进行称之为柱色谱，在薄层上进行称为薄层色谱。柱色谱由于别离量较大，主要应用于有机物和天然产物的纯化别离。薄层色谱主要应用于有机物的定性或定量分析，有时也可以用作微量有机物的别离。色谱法按照别离原理分类：1.吸附色谱：利用吸附剂外表对不同组分吸附能力的差异到达别离纯化的目的，称之为吸附层析。常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺。2.分配色谱：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同而别离的方法,称之为分配层析；常用支持剂为硅胶、硅藻土、纤维素等；固定相为水和油等不同极性的材料。3.离子交换色谱：利用不同

3、组别离子交换剂亲和力不同进行的别离称之为离子交换色谱。常用离子交换树脂：强酸型磺酸型；强碱型季胺型；弱酸型羧酸型；弱碱型三级胺型。4.凝胶色谱、亲和色谱等。4.1 薄层色谱别离制备一 薄层色谱(又称薄板色谱)Thin layer chromatography TLC将吸附剂均匀铺在玻璃板上，将欲分析的样品点加到薄层上，然后用适宜的溶剂展开而到达别离、鉴定定量的目的。薄层色谱1适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质2是柱色谱的先导3分类：吸附型Al2O3、硅胶G等作吸附剂 分配型硅藻土、纤维素等作支持剂4操作方法： 在洗涤干净的玻璃板153cm上均匀地涂上一层吸附剂或支

4、持剂，待枯燥、活化后将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约1cm处的起点线上，晾干或吹干后，置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为0.5cm。待展开剂前沿离顶端约1cm附近时，将板取出，枯燥后喷以显色剂或在紫外灯下显色或直接观察。TLC的特点及类型：价廉、设备简单、操作容易；展开时间短，检测结果快速；比纸层析的灵敏度高高10100倍；别离情况受温度影响小；显色剂可供选择的范围大；可以使用腐蚀性的显色剂，如喷浓硫酸，可以加热至500，观察碳化的斑点；可在同一块板上同时别离多个样品。因此假设将样品与标样同时展开，那么可定性；假设将样品与标样同时展开后的斑点浓度进行测量那么可定量；缺乏

5、之处，它的重现性比纸色谱差，展开大的薄层板时容易出现边缘效应。软板：将吸附剂直接在板上制成。硬板：在吸附剂中参加黏合剂或溶剂，调制后涂布于板上二.吸附剂的选择：1.常用的吸附剂有：硅胶、氧化铝、硅藻土、聚酰胺、纤维素等。氧化铝、硅胶吸附性能良好，适用于各类化合物的别离，应用最广。氧化铝：呈微碱性，适用于碱性物质和中性物质的别离，特别是生物碱的别离应用最多。硅胶：带微酸性，适用于酸性物质或中性物质的别离。常见吸附剂吸附能力的比较：蔗糖纤维素淀粉CaC03CaS04MgC03硅胶活性炭MgOA1203。对吸附剂的要求：具有均匀的结构和一定的比外表积。吸附剂的吸附能力同它的比外表积及颗粒细度相关，比

6、外表积越大，颗粒越细，吸附能力就越强。比外表积是单位质量的吸附剂所具有的外表积，以m2/g表示。具有一定的机械强度和稳定性。对展开剂和样品成分不分解、不破坏。具有可逆的吸附性。吸附与解吸都较容易。 最好为白色固体，以利于观测。选择吸附剂的依据：化合物的固有性质，包括溶解性，酸碱性，极性。化合物极性顺序如下：饱和烃不饱和烃醚酯醛、酮胺羟基化合物酸离子化合物如RN+H、RCOO-等2.几种常见的吸附剂类型：硅胶 G (Type 60)：粘合剂为石膏，T60表示硅胶的孔径为6nm。硅胶 H ：不含石膏及其它有机粘合剂，适用于别离对石膏有作用的化合物与硅胶 G 相比。硅胶 G254 ：同硅胶 G 一样

7、，但含有一种无机荧光剂，在=254nm紫外灯下呈现荧光。硅胶 60HR ：不含粘合剂的纯产品，适用于需要特别纯的薄层，用于别离的物质需要定量。氧化铝 G ：含石膏黏合剂(Type60G)，Type指氧化铝孔径为6nm。碱性氧化铝 H ：黏合力与氧化铝G相同，但不含黏合剂。三.薄层的制备：1.软板的制备：吸附剂：氧化铝和硅胶常用方法：选用一根直径为约11.2cm的玻璃管依据薄层所需的厚度在玻璃管两端绕几圈胶布厚度0.41mm，把干的吸附剂倒在玻璃板上，玻璃板一端固定，将玻璃管压在玻璃板上，把吸附剂顺一个方向推动而成薄板。2.硬板的制备：将适量调制好的吸附剂倒在玻璃板上，用玻璃棒涂匀，轻敲玻璃板，

8、使外表光滑，然后放置于水平台上，空气枯燥后，进行加热活化。硅胶板：100120加热活化12h；氧化铝：150200加热活化45h3.硅胶薄层：称取市售硅胶 G 30g，加蒸馏水80mL，在研钵内调成均匀的糊状，直至调制成无气泡出现为止必要时可加12滴乙醇，然后制板，室温枯燥后置烘箱100120活化1h左右。一般1g硅胶可涂布载玻片5-7块(7.5cm x 2.5cm)。4.氧化铝薄层：取氧化铝 G 25g，含5%煅烧石膏，加蒸馏水50mL在研钵中调成均匀糊状物，操作同硅胶G，枯燥后于烘箱活化活性II级的薄层：200220活化4h；IV级薄层：150160活化4h。5.聚酰胺和纤维素薄层一般用有

9、机溶剂，如：5g聚酰胺+甲醇3份+氯仿2份或苯2份的混合溶剂45mL，混匀调成糊状铺板。纤维素那么可用纤维素1份与5份丙酮混匀调成糊状而铺板。四.TLC操作方法：点样、展开、显色3个步骤。1.点样 首先将被检样品用适宜溶剂溶解，尽量稀释至浓度0.011%，最好采用与展开剂极性相近且有高挥发度的溶剂。定性分析可用管口平整的毛细管内径一般为0.5mm吸取样品轻轻接触到薄层板下端1cm处。定量分析需用刻度精确的微量注射器点样，如果一次加样量缺乏，可在溶剂挥发后，重复点样。如果一块薄板点几个样品时，样品间隔在0.51cm，而且需要在同一水平线上。2.展开 点样后，让溶剂挥发，然后进行展开，展开的过程是

10、混合物样品别离的过程。样品展开前，要选择好展开溶剂。展开的溶剂：低沸点的有机溶剂。展开剂选择的首要目的是使混合物样品的别离效果显著。一般要考虑被别离物质的极性及其和展开剂的亲和力。选择原那么为“相似性原那么。强极性试样用强极性展开剂，弱极性试样用弱极性展开剂。常用溶剂极性顺序为： 己烷石油醚二硫化碳苯四氯化碳二氯甲烷乙醚乙酸乙酯丙酮Li+ Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Ni2+ Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg2+UO22+ La3+Ce3+Pr3+Eu3+Y3+Se3+A13+ 2、弱酸性阳离子交换树脂 与强酸性阳离子交换树脂相同，只是对于H+亲合力大于其他阳离子。 3、强碱性阴离子交

11、换树脂 Cr2O72-SO42-I-NO3-CrO42-Br-CN-C1-OH-F-Ac- 4、弱碱性阴离子交换树脂 OH-SO42-CrO42-NO3-AsO43-PO43-Ac-I-Br-C1-F-离子交换色谱法 以强酸性阳离子交换树脂别离K+和Na+为例。当混合溶液从柱上方参加时，水相中的K+和Na+就与树脂活性基团中的H+发生交换，从而进入树脂相。交换过程可表示为： R- H+ + K+ = R- K+ + H+R- H+ + Na+ = R- Na+ + H+ 如再向交换柱上方参加稀盐酸溶液，此时树脂相中的K+和Na+又将与溶液中的H+发生交换，重新进入溶液。这一过程称为洗脱。洗脱过

12、程可表示为： R- K+ H+=R- H+ + K+ R- Na+ + H+ =R- H+ + Na+ 选取离子交换树脂时考虑的因素：样品溶液的性质：离子的组成，离子的总浓度，选择性条件，抗衡离子淋洗液条件：流速，温度，树脂层高再生条件：浓度，流速，温度离子交换别离的操作方法 在分析工作中，为了别离或富集某种离子。一般采用动态交换。这种交换方法在交换柱中进行，其操作过程如下。(一)树脂的选择和处理 在化学分析中应用最多的为强酸性阳离子交换树脂和强碱性阴离子交换树脂。生产上出厂的交换树脂颗粒大小往往不够均匀，故使用时应领先过筛以除去太大和太小的颗粒，也可以用水泡胀后用筛子在水中选取大小一定的颗粒

13、备用。 一般商品树脂含有一定量的杂质，所以在使用前必须进行净化处理。对强碱性和强酸性阴阳离子交换树脂，通常用4mol/LHCl溶液浸泡1-2天，以溶解各种杂质，然后用蒸馏水洗涤至中性。这样就得到在活性基团上含有可被交换的H+或Cl-的氢型阳离子交换树脂或氯型阴离子交换树脂。如果需要钠型阳离子交换树脂，那么用NaCl处理氢型阳离子交换树脂。 (二)装柱 进行离子交换通常在离子交换柱中进行。离子交换柱一般用玻璃制成，安装交换柱时，先在交换柱的下端铺上一层玻璃丝，灌入少量水，然后倾入带水的树脂，树脂就下沉而形成交换层。装柱时应防止树脂层中存留气泡，以免交换时试液与树脂无法充分接触。树脂高度一般约为柱

14、高的90%。为防止加试液时树脂被冲起，在柱的上端亦应铺一层玻璃纤维。交换柱装好后，再用蒸馏水洗涤，关上活塞，以备使用。应当注意不能使树脂露出水面，因为树脂露于空气中，当参加溶液时，树脂间隙中会产生气泡，而使交换不完全。交换柱也可以用滴定管代替。 (三)交换 将试液加到交换柱上，用活塞控制一定的流速进行交换。经过一段时间之后，上层树脂全部被交换、下层未被交换，中间那么局部被交换，这一段称为“交界层。随着交换的进行，交界层逐渐下移，至流出液中开始出现交换离子时，称为始漏点(亦称泄漏点或突破点)，此时交换柱上被交换离子的物质的量数称为始漏量。在到达始漏点时，交界层的下端刚到达交换柱的底部，而交换层中

15、尚有未被交换的树脂存在，所以始漏量总是小于总交换量。(四)洗脱 当交换完毕之后，一般用蒸馏水洗去残存溶液，然后用适当的洗脱液进行洗脱。在洗脱过程中，上层被交换的离子先被洗脱下来，经过下层未被交换的树脂时，又可以再度被交换。因此最初洗脱液中被交换离子的浓度等于零，随着洗脱的进行，洗出液离子浓度逐渐增大，到达最大值之后又逐渐减小，至完全洗脱，被洗出后离子浓度又等于零。 对于阳离子交换树脂常采用HCl溶液作为洗脱液，经过洗脱之后树脂转为氢型；阴离子交换树脂常采用NaCl或NaOH溶液作为洗脱液，经过洗脱之后，树脂转为氯型或氢氧型。因此洗脱之后的树脂已得到再生，用蒸馏水洗涤干净即可再次使用。影响操作的

16、因素1树脂粒度 树脂的粒度对交换速度及压力有显著的影响。2交换柱 树脂在柱中，溶液在流动状态下与树脂反复交换。通过树脂交换后溶液中的离子随之与树脂分开。树脂层越高，流速越慢，而交换量越大。3溶液的pH值影响 pH值会影响树脂上功能基的离解。4被交换物质溶液的浓度 离子交换树脂的交换容量不大，一般在低浓度下比较有利。5温度的影响 一 般温度增高，离子交换速度加快， 应用于有机物别离的离子交换树脂必须满足以下5个根本要求：交换量 在实际应用中，大局部树脂是装柱使用，一般要以体积交换容量；机械强度 在使用过程中，要求树脂不破裂，不丧失。一般以球形小颗粒(2080目)使用，处理比较方便；化学稳定性 要

17、求树脂使用寿命长，能耐有机溶剂、稀酸、稀碱及氧化剂和复原剂；选择性高，再生性能好；结构性能好 在使用条件下，树脂的孔度，孔径大小适宜，孔径分布窄，比外表积大。离子交换法的应用 (一)纯水的制备 天然水中常含一些无机盐类，为了除去这些无机盐类以便将水净化，可将水通过氢型强酸性阳离子交换树脂，除去各种阳离子。如以CaCl2代表水中的杂质，那么交换反响为： 2R-SO3H+Ca2+(R-SO3)2Ca+2H+ 再通过氢氧型强碱性阴离子交换树脂，除去各种阴离子。 RN(CH3)3OH+C1-RN(CH3)3Cl+OH- 交换下来的H+和OH-结合成H2O，这样就可以得到相当纯洁的所谓“去离子水，可以代

18、替蒸馏水使用。 (二)干扰离子的别离 1. 阴阳离子的别离 在分析测定过程中，其他离子的存在常有干扰。对不同电荷的离子，用离子交换别离的方法排除干扰最为方便。例如用BaSO4重量沉淀法测定黄铁矿中硫的含量时，由于大量Fe3+、Ca2+的存在，造成BaSO4沉淀的不纯，因此可先将试液通过氢型强酸性阳离子交换树脂除去干扰离子，然后再将流出液中的SO42-沉淀为BaSO4进行硫的测定，这样便可以大大提高测定的准确度。 2. 同性电荷离子的别离 如果要使几种阳离子别离开，可以根据各种离子对树脂的亲和力不同，将它们彼此别离。例如欲别离Li+、Na+、K+三种离子，将试液通过阳离子树脂交换柱，那么三种离子

19、均被交换在树脂上,然后用稀HCl洗脱，交换能力最小的Li+先流出柱外，其次是Na+而交换能力最大的K+最后流出来。 (三)微量组分的富集 以测定矿石中的铂、钯为例来说明。由于铂、钯在矿石中的含量一般为10-5-10-6，即使称取10克试样进行分析，也只含铂、钯0.1微克左右。因此，必须经过富集之后才能进行测定。富集的方法是：称取10-20克试样，在700灼烧之后用王水溶解，加浓HCl蒸发，铂、钯形成PtCl62-和PdCl42-络阴离子。稀释之后，通过强碱性阴离子交换，即可将铂富集在交换柱上。用稀HCl将树脂洗净之，取出树脂移入瓷钳锅中，在700灰化，用王水溶解残渣，加盐酸蒸发。然后在8mol

20、/LHCl介质中，钯(II)与双十二烷基二硫代乙二酰胺(DDO)生成黄色络合物，用石油醚-三氯甲烷混合溶剂萃取，用比色法测定钯。铂(IV)用二氯化锡复原为铂(II)，与DDO生成樱红色螯合物可进行比色法测定。 四、聚酰胺柱色谱是通过酰氨基聚合而成的一类高分子化合物，分子中含有丰富的酰氨基，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键结合而被吸附，而使这些有机物与不能形成氢键的化合物别离。脫吸附剂是水和递增甲醇或乙醇的含量的水溶液。聚酰铵具有“双重色谱的性能，因聚酰胺分子中既有非极性的脂肪键又有极性的酰氨基团，当用含水极性溶剂为移动相时，聚酰胺作为非极性固定相，当用非极性氯仿甲醇为移动相时，聚酰胺

21、那么作为极性固定相。五、凝胶柱色谱凝胶色谱法所使用的固定相凝胶是含有许多孔隙的网状结构固体，具有分子筛性质。别离原理：利用有机物分子大小的差异来进行别离。当混合物通过凝胶相时，比孔隙小的分子可以自由进入凝胶内部，而比孔隙大的分子那么不能进入，这样就在移动速度方面就产生了差异。大分子有机物不被迟滞而随溶液走在前面，小分子那么由于向孔隙内扩散或移动得到滞留，所以落后于大分子而得到别离。凝胶有亲水性和疏水性两种类型。(1)亲水性凝胶：主要由交联葡聚糖或琼脂糖、聚丙烯胺小球以及葡聚糖衍生物。最常见的凝胶是交联葡聚糖系列，它是由葡聚糖和甘油基通过醚桥相交联而成的多孔性网状结构。亲水性凝胶用于大分子的肽、

22、蛋白质和多糖的别离。2)疏水性凝胶：它是在交联葡聚糖分子中引入一个基团增大其亲脂性，适用于难溶于水的亲脂性化学成分别离。优点：a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用凝胶的类型：亲水性和疏水性, 成型商品如下：Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel ABio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水量（g/g干凝胶）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作范围（肽与蛋白）D700

23、15000.15的情况下，在 10-15分钟可快速得到别离。该法首先由 still于 1978年详细介绍，1981年获专利保护。一、实验条件 1、吸附剂硅胶：选用 60埃，粒度为 40-63um (230-400目)。过大、过小都会使别离度减少。2、流动相 A 、通常以 TLC层析条件为依据，对被别离成分，要求 Rf值在 0.35左右。 B、选择在 TLC板上对混合成分有良好的别离。要求Rf0.15 Rf值=0.1时，上样量小时也能别离。 C、流速：由实验证实，使用硅胶 60 4063um作为固定相，流速为 2in/min时，可得到好的分辨率3、干法装柱：硅胶高度 5-6in15cm左右装柱法

24、与普通法相同溶剂参加后，加压，排除空气，并使硅胶溶剂化。 4、上样、洗脱与收集采用 40-63um硅胶为吸附剂时，柱的大小、硅较用量、加样量、每次收集的体积见表压力泵一般要求 2 即可。可通过控制流速 2in/min 来实现。与层析柱上端相接的塞子是一个压力控制伐，可调节压力而调节流速如下图。减压液相柱色谱VLCVacuum Liquid Chromatography又称之为真空液相色谱是近几年来国外实验室迅速开展起来的新技术，它是利用柱后减压使洗脱剂迅速通过固定相从而很好的别离样品的色谱技术。 VLC具有快速，简易，高效，价廉等优点，目前已成功的应用于有机制备以及天然产物如萜类，类酯，双萜及

25、多种生物样品的别离。VLC特点 VLC不同于常压柱层析和快速柱层析 Fcc，因为后两者洗脱剂是连续的，在操作中不会间断；而 VLC进行溶剂洗脱时，在加洗脱剂后，在柱后减压下全部抽出，每一次洗脱收集一次，抽干后，再更换溶剂，并再进行下一个流分的收集，FCC采用柱前加压，而 VLC采用柱后减压.VLC可别离样品量达几十克，而 FCC只能别离几克。 VLC吸附剂经处理后可反复使用。实验条件 1.固定相；常采用 TLC用硅胶、Al2O3,粒度：10um40um硅胶 60H或 60G聚酰胺等 2. 装柱：干法装柱法。将吸附剂装入漏斗或短柱中，轻轻拍紧或减压拍打或从顶端挤压，直至吸附剂紧密，晒后变得坚硬。

26、吸附剂的高度一般不超过 5cm。 3，吸附剂用量：1对于微量别离，样品100mg,可采用直径为 0.51cm色谱柱或漏斗，吸附剂高度为 5cm，一般固定相用量为 1015：1倍，可在小试管中收集流分。2对于 0.51.0g样品，柱中装有 2.54cm高度的吸附剂较适宜。3对于 110g样品的别离，可在柱中装入 55cm的吸附剂。4较大样品别离，晒好采用 250ml砂芯漏斗中进行。吸附剂的高度为 5cm。可用三角烧瓶收集之。加大吸附剂与样品比例，可提高别离度。常用比例为 30：1300：1 上样放掉真空后，常压下参加低极性溶剂于吸附剂外表上，减压使溶剂均刀流过吸附剂。如有空隙，需要重装。使柱子抽

27、干后，重复 12次，即可准备上样。 A用低极性溶剂或洗脱剂如石油醚、正己烷溶解样品。常压下小心参加柱顶端，再参加洗脱剂或溶剂覆盖吸附剂外表，慢慢减压，使样品在柱顶端形成样品层。B可也采用固体上样法。即先将样品溶于极性溶剂，参加 510份吸附剂，旋转蒸发至干后，加到吸附剂的外表上，然后进行洗脱。VLC流动相选择与柱层析相同，先用 TLC来选择条件。VLC更适用于梯度洗脱，可用二元，三元混合溶剂系统。一般先用极性较小溶剂，如石油醚、正己烷、环己烷，然后逐渐加大极性CH2Cl2、Et2O、AcOEt、 CH3OH极性溶剂的增加开始要缓慢1%，2%，3%等，然后增加的幅度可逐渐增大5% 10% 20%

28、等，通常收集 2025个流分可将所有成分洗脱。洗脱与收集用适当溶剂系统洗脱或用梯度洗脱gradient elution。在常压下，参加溶剂后，将柱抽干，收集为一个流分。真空度要求 2070mmHg；抽干后再更换溶剂和容器，重复以上操作，并用 TLC跟踪每一个流分的别离情况先摸一摸再行动。为防止每一流分拆卸漏斗，可采用图 B的方法，该抽滤甁底部为磨口，减去负压后，更换接受甁。三、干柱色谱是将干的吸附剂装入色谱柱中，将待别离的样品配成浓溶液或吸附于少量填料上，然后上样。当洗脱液依靠毛细作用从柱上流下，接近色谱柱底部时，停止洗脱。将将吸附剂根据柱上各色带挖出或切开，再用适当溶剂洗出。操作：将吸附剂填充到塑料薄膜柱中，把欲别离混合物置于柱子顶端，加展开剂展开，当展开剂到达柱底部时即完成别离。用小刀沿着别离部位将柱子切开，从