生理生化试验复习30题-答

1、复习题及答题要点由题人：陈福龙一、名词解释：1、分配层析法：是利用物质在两种不同的混合溶剂中的分配系数不同， 而达到分离目的的一种实验方法。 在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即a =溶质在固定相的浓度（Cs） /溶质 在流动相白浓度（Cl）。2、水势：任一体系水的化学势 财和纯水的化学势 Q闻之差，除以水的偏摩尔体积（ V 所得到的 商值，表示为：水势W w= （ W /Vw= A W V w3、电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。4、同工酶：指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。5、荧光现象：叶绿素提

2、取液在透射光下呈绿色，在反射光下呈暗红色或棕红色的现象。6、自由基：共价键均裂产生的具有奇数个电子或不配对电子的原子、原子团、分子或离子。7、分光光度法：是利用物质对某一波长的光有着很强的光吸收，具有特定的吸收光谱，利用分光光度计 来测定其最大光吸收值，通过光吸收值与该物质浓度之间的比例关系来定性、 定量测定该物质的一种实验 方法。8、诱导酶：植物体内本身不含某种酶，当加入特定的诱导物，诱导产生的酶，它的含量在诱导物存 在下显著提高，这种诱导物一般是该酶底物本身或底物的类似物。9、还原糖：具有自由醛基或酮基的单糖（如葡萄糖、果糖）和某些二糖（如麦芽糖、乳糖等）。10、电渗现象：电场中，液体相对

3、于固体支持物的相对移动的现象。二、 问答题：1、简述纸层析的基本原理？答：纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法， 溶剂系统由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较 强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相；有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以滤纸毛细管中自由流动， 形成流动相，层析时将滤纸一端进入层析溶剂，有机溶剂连续不断的通过点有样品的原点处，使其中的溶 质依据本身的分配系数在两相间进行分配。 由于混合液中各种氨基酸的a值不同，其在两相中的分配数量 及移动速率（即化移率R值）就不同，从而达到分离的目的。移动速率R=原点到层析点中心的距离/原点 到溶剂前沿的距离。2、影响Rf值的主要因素有哪些？答：(1

4、)物质的极性，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。(2)溶质与溶剂间的相互作用，溶质和溶剂之间若能形成氢键，对分配系数的影响很大。pH值影响主要由pH与分配系数的关系所决定的，溶剂的pH还可以影响流动相的含水量。(4)滤纸的质地和溶剂的饱和程度。(5)溶剂的纯度和含水量。(6)室验室的温度和时间对分配系数也有影响3、简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的三种物理效应？ 答：不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中主要存在以下三种物理效应：(1)电荷效应：酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定的电极以一定的速度泳动。(2)分子筛效应：相对分子质量或构型不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时

5、，所受摩搽不同，受 阻程度不同，表现出不同的迁移率。(3)浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中被压缩成层，使原来很稀的样品得到高度的浓缩。 4、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中，浓缩效应是如何产生的？ 答：原因如下：(1)由于两层胶的孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。 这样，就在两层凝胶交界处使待分离的酶蛋白区带变窄，浓度升高。(2)在聚丙烯酰胺凝胶中用的都是 Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶的pH为6.7,下层分离胶的pH 为8.9。HCl为强电解质，不管在哪层胶中几乎全部电离，Cl-布满整个胶待分离的酶蛋白加在点样孔，浸在pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液中

6、。电泳一开始，有效泳动率最大的 Cl-迅速跑到最前面，成为快离子，在 pH 为6.7条件下解离度仅有0.1 1%的 甘氨酸有效泳动率最低，跑到最后面，成为慢离子，。这样在，快慢 离子之间就形成一个不断移动的 界面。在pH为6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢 离子之间，被夹持分布在界面附近，逐渐形成一个区带。由于快离子的 快速向前移动，其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。根据电位 梯度V、电流强度I和电导率S之间的 关系：V=I/S,所以，在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较 高的 电位梯度。这种在 电泳开始后产生的 高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前

7、进，追赶快 离子。酶蛋白区带在追赶过程中逐渐压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的 浓缩效应。在此区带中，各种酶蛋白又按其电荷分成不同层次， 在进入分离胶前初步被分离，形成若干条离得很近但又不同 的起跑线。5、小液流法测定植物组织水势的原理是什么？答：当植物组织与外液接触时，如果植物组织的水势Ww低于外液的渗透势(溶质势)Ws,组织吸水、外液浓度比原浓度增大，比重也增大，着色后有色液滴下降；反之，则组织失水、外液浓 度减小，有色液滴上升；若两者相等，则水分交换保持动态平衡，组织重量及外液浓度保持不变。根据外液浓度(或组织重量)的变化情况即可确定与植物组织相同水势的溶液浓度，然后根据公式 3

8、s=-iCRT计算出溶液的渗透势，即为植物组织的水势。6、简述2, 6二氯酚靛酚法测定植物组织维生素C含量时，在操作过程中应注意的主要事项。答：(1)某些蔬菜、水果(如橘子、西红柿)浆状物泡沫太多，可加入数滴辛醇或丁醇；(2)整个操作过程要迅速，防止还原型的抗坏血酸被氧化。滴定过程一般不超过2min,滴定所用的染料不应小于1ml或多于4ml;(3)本实验必须在酸性的条件下，因为在酸性条件下，干扰物质反应比较慢；2%勺草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的活性，而 1%勺草酸无此作用。Fe2+可还原2、6二氯酚靛酚，如果有大量的Fe2+干扰，用8%的乙酸替换草酸提取；提取液中，如有很多的色素干扰，可加白陶土

9、脱色，或加 1ml氯仿，终点时，氯仿层呈淡红色；提取的浆状物如不易过滤，可用离心沉淀方法，除去沉淀杂质，取上清液滴定。7、请列举至少四种快速测定植物种子发芽率的方法及其基本原理。答：(1) TTC法：TTC (2, 3, 5-氯化三苯基四氮吵)氧化态为无色，被氢还原后，则生成红色的三苯基 甲簪(TTF),具有生活力的种胚，在呼吸过程中都有氧化还原反应，当浸于 TTC溶液中时，由于吸收呼吸 作用产生的NADK NADPH:的氢，能使无色的TTC还原成红色的TTF,因此种子胚部便染成红色；而无生 活力的种子胚则无此反应，胚部不着色。所以可根据种子胚部的染色状况来判断种子生活力和发芽率。BTB (澳

10、麝香草酚蓝)法：生活种子吸胀后，呼吸强度急剧增加，呼出的二氧化碳溶于水成为碳 酸，进一步离解为H+和HCO ,种胚周围的酸度增加。因此，可用适当的pH指示剂的颜色变化测定种子生 活力。澳麝香草酚蓝的变色范围是pH6.07.6,变色点是pH7.1o碱性是兰色，酸性是黄色，转折点是绿 色。凡种胚附近出现较深的黄晕光圈的是活种子，无的则是死种子。(3)红墨水(酸性曙红)法：酸性曙红染色法是根据生活细胞原生质有分别透性，对某些不能透过 的原理。因此用这类染料不能将活胚染色，而能将死胚染色。(4)过氧化氢法：生活种子内有过氧化氢酶的存在，能分解过氧化氢放出氧气，死种子的细胞中， 过氧化氢酶被破坏，故不能

11、分解过氧化氢放出氧气。8、简答琼脂糖凝胶电泳中用荧光染料EB进行染色的原理？答：原理是EB是一种扁平分子，它可以嵌入核酸双链配对碱基或碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸收254nm的紫外线后将能量传递给EB,二是EB本身吸收302nm和360nm的紫外线的能量。这两方面的能量最终激发EB发射波长为590nm的可见光(红橙区)。9、琼脂糖凝胶电泳常用荧光染料EB进行染色有什么优点？答：(1)染色比较简便、快捷，一般在 1015min就可反应。EB对核酸分子无破坏作用，这一点是其它染料所不能做到的。EB灵敏度高，可检测出 10ng或更少的DN哈量。

12、既可用于 DNAfe可用于RNA的检测。EB可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外灯检测电泳的进程和效果。EB-DNA复合物中的EB发出的荧光比游离的 EB强10倍，因此不需洗净凝胶中游离的EB也可检测出DNA的条带。10、在不连续的 PAG即，其不连续性体现在哪些方面？答：PAGE根据其有无浓缩胶分为连续PAGE和不连续PAGE两种，本实验采用的是不连续PAGE。 不连续性表现在以下几个方面：(1)凝胶由上下两层组成，两层凝胶的孔径不同；(2)缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同；(3)在电场中形成不连续的电位梯度。11、影响电泳的主要因素有哪些？答：根据有效迁移率(I = ma=qa/6

13、 7trr,则可推出影响电泳的主要因素有：(1)带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快。(2)带电颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快。(3)电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快。(4)溶3的pH值：离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快。(5)溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快。(6)离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快。(7)电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的移动。(8)支持物筛孔大小：孔径越小，电泳速度越慢，反之越快。12、在不连续的PAGE中，分离胶与浓缩胶分别由什么催化诱发系统所催化，分别发生了什么性质的聚合作用？答：在不连

14、续的PAG即，凝胶是由丙烯酰胺单体(Acr)和交联剂N, N-甲叉双丙烯酰胺(Bis) 在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，它们就聚合。引发产生自由基的方法有 两种：化学法和光聚合法。分离胶是化学聚合，引发剂是过硫酸镂 (AP),催化剂N、N、N、N四甲基 乙二胺(TEMED),它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链，化学 聚合形成的凝胶孔径较小；浓缩胶是光聚合法的催化的，催化剂是核黄素(VB2),(可不加TEMED)光聚 合形成的凝胶孔径较大。13、聚丙烯酰胺凝胶适用于作区带电泳支持介质的结构特点是什么？答：(1)聚丙烯酰胺的基本结构为

15、丙烯酰胺单体构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；(2)链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛的性质(3)网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有抗对流的作用；(4)长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶；(5)该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些结构特点使得聚丙烯酰胺特别适用于作区带电泳支持介质。14、提纯核酸，应注意哪些问题？答：（1）避免过酸、过碱和高温的环境，合适的 T: 04C, pH4-9;（2）防止机械力的切割作用，避免剧烈振荡；（3）防止核酸酶的降解作用，可加入抑制剂EDTA柠檬酸钠；（4）整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，降低减少核酸变

16、性、降解、机械切割的机会。15、以菠菜叶片为材料，如何提取叶绿体色素并进行分离？答：（1）色素的提取：称取3g菠菜（去叶脉），加入少量的石英砂和CaCO及2ml 80%勺丙酮研成匀浆， 在加入80%勺丙酮10ml浸提5分钟，过滤于烧杯中，残渣再用8ml丙酮冲洗，滤液用80殉酮定容至25ml。（2）纸层析分离：取圆形的定性滤纸一张（直径11cm）,用打孔器在中心戳一个小孔（直径约 3mm, 另准备一张长10cm宽3cm的滤纸条，沿长度方向，距一边0.5cm处，用毛细管点叶绿素提取液，扩散宽 度限制在0.5cm以内，点5次左右，每点一次用吹风机吹干，沿长度方向卷成纸捻，将纸捻点样端插入圆 孔中，勿

17、突出，在微烧杯中加入展层液，将纸捻另一断放入展层液，盖上培养皿盖，此时，推动剂借助毛 细管引力顺着纸捻扩散至圆形滤纸上把色素向四周推动，接近边缘处停止，吹干。16、叶绿体色素利用环行纸层析分离之后，你会看到什么现象？答：叶绿体色素利用环行纸层析分离之后吹干，滤纸上呈现四圈同心圆环色带，从外到内依次为胡萝卜素（橙黄色）-叶黄素（黄色）-叶绿素a （蓝绿色）-叶绿素b （黄绿色）。17、分别说出叶绿体色素的三个重要理论性质即皂化反应，取代反应及荧光现象在实验当中看到的现象？答：（1）荧光现象：在试管中加5ml提取液，在反射光下暗红色或棕红色，在透射光下为绿色。（2）皂化反应：在试管中加入5ml提取

18、液，加入2ml 20%的KOH-甲醇溶液，充分摇匀，片刻后加入 5ml苯，摇匀，再缓慢沿试管壁加入1-1.5ml蒸储水，轻轻混匀，于试管架上静置，现象是分两层，上层 为溶有类胡萝卜素的淡黄色的苯溶液，下层为溶有皂化的叶绿素的绿色的甲醇水溶液。（3）取代反应：在一支试管中加入 5ml提取液，再加入6N的HCl数滴，摇匀，颜色变化为褐色再加 入少量的醋酸铜粉末，微热，颜色变为鲜绿色。18、绿色浸渍植物标本的绿色为什么能保持较长的时间？答：叶绿素化学性质不稳定，易受强光的破坏，特别是叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。叶绿素中 的镁可被H+所取代，而成褐色的去镁叶绿素，后者遇到 Cu2+则成为绿色铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定， 在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的标本19、简答几种常见的测定蛋白质含量的方法及原理？答：（1）双缩月尿法：原理是蛋白质含有两个以上的肽键（-CO-NH-）因此，有双缩月尿反应，在碱性溶液中 蛋白质与CiT形成紫色络合物，其颜色深浅