真菌杀灭试验

1、真菌杀灭试验2.1.1.9.1目的在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上真菌生殖体或真菌孢子所需剂量，以考证对真菌及其孢子适用消毒剂量。2.1.1.9.2试验器械麦芽浸膏琼脂（MEA）：见附录A。沙堡琼脂培育基：见附录A。试验菌及其菌悬液或菌片的制备白色念珠菌ATCC10231和黑曲霉菌ATCC16404或孢子悬液与菌片按2.1.1.9.3(1)和2.1.1.9.3(2)所示方法制备。别的，依据消毒剂特定用途和特别需要，可采用其余真菌或孢子悬液与菌片。（4）中和剂(依据2.1.1.5所示方法判定合格者)。（5）磷酸盐缓冲液(PBS，0.03mol/L，pH7.2)。6）消毒剂稀释用硬水：见附录

2、A。7）有机扰乱物质：见附录A。8）刻度吸管(0.1ml、1.0ml、5.0ml)。9）恒温水浴箱。10）喷雾装置（用于喷雾消毒试验）。11）电动混淆器。12）计时装置。2.1.1.9.3真菌悬液制备（1）白色念珠菌悬液的制备1）取冻干菌种管，以无菌操作翻开，用毛细吸管吸加适当沙堡液体培育鉴于管中，柔和吹吸数次，使菌种消融分别。取含5.0ml10.0ml沙堡液体培育基试管，滴入少量菌种悬液，置37培育18h24h。用接种环取第1代培育的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培育基平板上，于37培育18h24h。挑取上述第2代培育物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，于37培育18h24h，即为第3代培育物。将

3、其密封后在4保留，时间不得超出6周。2）试验时，取第3代斜面培育物在砂堡琼脂斜面上连续传代，方法与第3代同样。取第5代或6代的沙堡琼脂培育基斜面新鲜培育物18h24h），用5.0ml吸管汲取3.0ml5.0ml稀释液加入斜面试管内，频频吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混淆器混淆20s，或在手掌上振敲80次，以使白色念珠菌菌悬浮平均。3）悬液杀菌试验时，实验用菌悬液的含菌量为1107cfu/ml5107cfu/ml；菌片制备按2.1.1.2要求进行。4）菌悬液保留在4冰箱内备用。当日使用不得留宿。5）思疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定

4、。菌落形态可直接用显微镜察看。菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜察看，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜）后察看。（2）黑曲霉ATCC16404悬液或菌片的制备。取冻干菌种管，以无菌操作翻开，用毛细管汲取少量麦芽浸膏肉汤培育基加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种积淀物消融分别。取少量积淀物悬液加到含5.0ml麦芽浸膏营养肉汤培育基试管中，置301培育42h48h。用接种环划线接种第1代培育物于MEA培育基平板，置301培育箱中培育42h48h。取平板培育物中的典型菌落，接种于麦芽浸膏营养琼脂斜面培育基，置301培育箱中培育42h48h，即为第3代培育物。将其密封后在4保留，时间

5、不得超出9周。试验时，取第3代斜面培育物接种麦芽浸膏琼脂斜面，30培育48h，获得3.05.0ml麦芽浸膏肉汤，洗下斜面上的培育物，接种罗氏瓶，并摇动使菌液充满MEA培育基表面，而后吸弃剩余肉汤培育物液体，置301培育7d9d。向罗氏瓶培育物中加入5.0ml10.0ml0.05%（V/V）吐温80生理盐水溶液，刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中，将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中，轻轻振摇1min后，滤过除掉菌丝。滤事后，显微镜下（400倍）察看能否存在菌丝，若悬液中有菌丝存在，可经5000r/min6000r/min，离心20min。再次在显微镜下（400倍）察看，若悬液中仍有菌丝存在，须再离心。黑

6、曲霉分生孢子悬液在28储藏不可以超出2d，使用前，混淆平均，在显微镜下（400倍）察看能否有孢子出芽，如有孢子出芽，则弃之不用。使用时，可用稀释液适合稀释。悬液试验时实验用菌悬液的含菌量为1107cfu/ml5107cfu/ml。6)制备染菌样片刻染菌方法为滴染法，每片加菌悬液10l。染菌后，置37培育箱内干燥(约30min)，或置室温下自然阴干后再使用。回收菌数应达5105cfu/片5106cfu/片，可依试验要求确立。2.1.1.9.4试验分组试验分为以下各组:试验组，按2.1.1.7.3规定，选定消毒剂浓度与作用时间，对受试菌种的杀灭能力进行测定。(2)阳性比较组，以硬水取代消毒剂溶液，

7、按2.1.1.7.3规定程序进行试验。所得结果代表试验系统中所含试验菌的初始浓度，并以其计算消毒因子对试验菌的杀灭对数值。阴性比较组，察看同次试验用有关溶液和培育基有无污染。2.1.1.9.5试验程序常用杀灭试验有：悬液定量杀菌试验、载体浸泡定量杀菌试验、载体喷雾定量杀菌试验等。培育基对白色念珠菌为沙堡葡萄糖琼脂，对黑曲霉菌为麦芽浸膏琼脂（MEA）。其操作程序详见2.1.1.7。活菌培育计数时，对白色念珠菌，在37培育箱中培育48h察看最终结果。对黑曲霉菌，在30培育箱中培育72h察看最后结果。2.1.1.9.6评论规定产品监察查验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重复试验3次，对白

8、色念珠菌和黑曲霉菌各次试验的杀灭对数值均4.00，要求载体定量杀灭试验，各次试验的杀灭对数值均3.00，可判断该产品对真菌污染物消毒合格。产品申报卫生同意查验，按产品使用说明书指定的使用浓度和3个作用时间，重复试验3次，要求悬液定量杀灭试验在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值均应4.00，在产品使用说明书规定使用浓度与最低作用时间的0.5倍时，同意杀灭对数值4.00，可判为实验室试验该产品对真菌污染物消毒的有效剂量。用载体浸泡定量杀灭试验评论杀菌成效时，在产品使用说明书规定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，各次试验的杀灭对数值3.00，在产品使