酶的化学修饰市公开课获奖课件

1、退出 Enzyme Engineering酶工程第1页第1页第五章 酶化学修饰第一节 概述 第二节 酶分子化学修饰办法学 第三节 酶分子侧链基团化学修饰 第四节 有机大分子对酶修饰 第五节金属离子置换修饰及物理修饰第六节 酶化学修饰应用 第2页第2页第一节 概述 一、 概念二、 进行化学修饰原因三、 化学修饰基本原理四、 修饰酶特点 第3页第3页一、概念 酶化学修饰 利用各种修饰剂含有化学基团，与酶分子上某种氨基酸残基产生化学反应，使酶分子结构发生改变，从而改变酶一些特性和功效技术修饰酶 在体外用一定化学办法将酶和一些试剂进行共价连接后而形成酶体外改造第4页第4页二、 进行化学修饰原因稳定性不

2、够，不能适应大量生产需要作用最适条件不符，活性不高临床应用特殊要求：也许含有抗原性第5页第5页三、 化学修饰基本原理1、如何增强酶天然构象稳定性与耐热性2、如何保护酶活性部位与抗克制剂3、如何维持酶功效结构完整性与抗蛋白 水解酶4、如何消除酶抗原性及稳定酶微环境第6页第6页四、 修饰酶特点1、热稳定性增长2、增长抗克制剂、抗蛋白水解酶能力，体 内半衰期延长3、消除了酶抗原性4、微环境稳定性增强，最适pH改变5、酶学性质改变第7页第7页第一节结束概念进行化学修饰原因 化学修饰基本原理修饰酶特点第8页第8页第一节结束点击返回 第9页第9页第二节 酶分子化学修饰办法学 一、 修饰需考虑问题二、 选择

3、酶分子修饰剂三、 修饰反应普通程序四、 测定修饰程度和修饰部位五、 酶修饰办法第10页第10页一、 修饰需考虑问题1、 酶性质理解 (1) 酶活性部位情况 (2) 酶稳定条件、酶反应最适条件 (3) 酶分子侧链基团化学性质及反应活 泼性等第11页第11页一、 修饰需考虑问题2、 选择反应条件 (1) 反应体系中酶与修饰剂分子百分比 (2) 反应体系溶剂性质，pH条件和离子强度 (3) 反应温度及时间 (4) 其它第12页第12页二、 选择酶分子修饰剂修饰剂须具备特性1、 能选择性地与一个氨基酸残基反应2、 反应在确保酶蛋白不变性条件下进行 3、 被标识残基在肽中稳定，容易通过降解分离 出来并鉴

4、定4、 反应程度能用简朴技术测定第13页第13页二、 选择酶分子修饰剂修饰剂选择1、 修饰剂相对分子质量、修饰剂链长度对蛋 白质吸附性2、 修饰剂上反应基团数目及位置3、 修饰剂上反应基团活化办法与条件第14页第14页三、 修饰反应普通程序修饰反应 终止 稀释 阳离子互换 洗涤 过滤 干燥第15页第15页三、 修饰反应普通程序注意事项修饰后需进行总氨基酸分析各种酶分子，修饰后均需对每个氨基酸残基进行拟定注意缓冲液成份或修饰副产物对修饰部位和修饰程度及对酶活性影响修饰后酶性质改变第16页第16页四、 测定修饰程度和修饰部位修饰反应评价原因1、 有多少修饰剂已结合到酶分子上2、 哪些氨基酸被修饰，

5、修饰度是多少3、 有多少种不同形式修饰剂酶分子耦合物， 每种各有多少4、 表面修饰、内部修饰 测定方法第17页第17页五、 酶修饰办法侧链基团化学修饰大分子结合修饰其它(金属离子置换修饰、物理修饰)第18页第18页第二节结束酶分子性质理解选择酶分子修饰剂选择反应条件修饰反应要注意其它问题修饰反应普通程序测定修饰程度和修饰部位酶修饰办法第19页第19页第二节结束点击返回 第20页第20页第三节 酶分子侧链基团化学修饰 一、 概述二、 几种主要修饰反应 三、 特定氨基酸残基侧链基团化学修饰第21页第21页一、 概述侧链基团修饰 采用一定办法(普通为化学法)使酶分子侧链基团发生改变，从而改变酶分子特

6、性和功效修饰办法酶侧链基团 构成蛋白质氨基酸残基上功效团。有氨基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基等第22页第22页一、 概述作用研究各基团作用及其对酶结构、特性和功效影响(研究酶活性中心必需基团)改变酶分子性质，提升实用价值测定某一基团在酶分子中数量取得新酶种第23页第23页一、 概述类别蛋白类酶核酸类酶 侧链基团：磷酸基，核糖上羟基，嘌呤、嘧啶碱基上氨基和羟基(酮基)等第24页第24页二、 几种主要修饰反应 酰化及其相关反应 烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应第25页第25页酰化及其相关反应第26页第26页烷基化反应 第27页第27页氧化和还原反应 第28页第2

7、8页芳香环取代反应 定量测定第29页第29页三、 特定氨基酸残基侧链基团化学修饰巯基氨基羧基咪唑基胍基二硫键第30页第30页1、 巯基化学修饰 巯基：许多酶活性中心催化基团；形成二硫 键，稳定酶结构巯基含有很强亲核性，采用巯基修饰剂与酶蛋白侧链上巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶空间构象、特性和功效。提升酶稳定性惯用：酰化基、烷基化剂、马来酰亚胺、二硫苏 糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠第31页第31页第32页第32页2、 氨基化学修饰 氨基甲基化与乙酰化 赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酰胺侧链氨基；谷氨酰胺和天冬氨酸羧基-OH上 甲基转移酶氨基烷基化 脱氨基作用或与氨基共价结合，屏蔽酶分

8、子侧链上氨基 修饰剂：亚硝酸、2,4-二硝基氟苯(DNFB)、丹磺酰氯(DNS)、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亚胺甲酯第33页第33页第34页第34页3、羧基化学修饰 修饰剂与酶分子侧链羧基进行酯化、酰基化等反应修饰剂：碳化二亚胺、重氮基乙酸盐、乙醇-盐酸试剂、异噁唑盐等第35页第35页第36页第36页4、 咪唑基化学修饰 组氨酸。许多酶活性中心必需基团修饰剂通过咪唑基氮原子烷基化或碳原子亲核取代进行修饰修饰剂：碘乙酸、焦碳酸二乙酯第37页第37页第38页第38页5、 胍基化学修饰 精氨酸。在结合带有阴离子底物酶活性部位中起主要作用一些二羰基化合物在中性或弱碱性条件下与精氨酸胍基生成稳定杂环

9、修饰剂：丁二酮、1,2-环己二酮、丙二醛、苯乙二醛等第39页第39页第40页第40页6、 二硫键化学修饰 同巯基基团类似还原办法与巯基修饰办法结合，制止再氧化成二硫键。可用于计算断裂二硫键数目修饰剂：巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、过甲酸等第41页第41页第42页第42页第三节结束酰化及其相关反应 烷基化反应 氧化还原反应 芳香环取代反应巯基化学修饰 氨基化学修饰 羧基化学修饰 咪唑基化学修饰 胍基化学修饰 二硫键化学修饰概述 几种主要修饰反应 特定氨基酸残基侧链基团化学修饰第43页第43页第三节结束点击返回 第44页第44页第四节 大分子结合修饰一、 概念二、 大分子

10、结合修饰办法三、 大分子结合修饰作用第45页第45页一、 概念利用水溶性大分子与酶结合，使酶空间结构发生一些精细改变，从而改变酶特性与功效办法称为大分子结合修饰法，简称为大分子结合法第46页第46页二、 大分子结合修饰办法修饰剂选择修饰剂活化修饰分离第47页第47页1、修饰剂选择水溶性大分子。如聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、蔗糖聚合物、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等PEG: 110KD。溶解度高，无抗原性，无毒 性，生物相容性好第48页第48页2、修饰剂活化需活化才干与酶分子侧链基团进行反应eg. 单甲氧基聚乙二醇(MPEG) (1) 聚乙二醇均三嗪衍生物 MPEG1, MP

11、EG2。对天冬酰胺酶等氨基进行修饰 (2) 聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物 SS-MPEG, SSA-MPEG, SC-MPEG。pH7-10条件下对酶分子氨基进行修饰 (3) 聚乙二醇马来酸酐衍生物 PM。其中马来酸酐通过酰胺键对酶分子上氨基进行修饰 (4) 聚乙二醇胺类衍生物 对酶分子上羰基进行修饰第49页第49页3、修饰将活化大分子修饰剂与经分离纯化酶液以一定百分比混合，在一定温度、pH等条件下反应。使修饰剂活化基团与酶分子侧链基团共价结合，进行修饰第50页第50页4、分离经过凝胶层析等方法，将含有不同修饰程度酶分子分开，从中取得含有很好修饰效果修饰酶第51页第51页三、大分子结合修饰作用提升

12、酶活力增强酶稳定性减少或消除抗原性酶半衰期相对稳定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70ficoll(低分子量)-SOD14h140ficoll(高分子量)-SOD24h240聚乙二醇-SOD35h350天然SOD与修饰后SOD在人体血浆中半衰期第52页第52页第四节结束概念 大分子结合修饰办法 大分子结合修饰作用修饰剂选择修饰剂活化修饰分离提升酶活力增强酶稳定性减少或消除抗原性第53页第53页第四节结束点击返回 第54页第54页第五节 金属离子置换修饰及物理修饰一、 金属离子置换修饰二、 物理修饰第55页第55页一、 金属离子置换修饰1、 概念 把酶分子中金属离子换成另一个金属离子，

13、使酶特性和功效发生改变修饰办法，称为金属离子置换修饰第56页第56页一、 金属离子置换修饰2、 办法 酶分离纯化 除去原有金属离子 加入置换离子加入金属螯合剂(EDTA)，形成螯合物，透析、超滤、分子筛层析等除去普通都是二价金属离子。比如Ca2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等只适合用于哪些在分子结构中本来含有金属离子酶第57页第57页一、 金属离子置换修饰3、 作用 阐明金属离子对酶催化作用影响提升酶活力增强酶稳定性改变酶动力学特性第58页第58页二、 物理修饰1、 概念 通过各种物理办法使酶分子空间构象发生一些改变，从而改变酶一些特性和功效办法，称为酶分子物理修饰第59

14、页第59页二、 物理修饰2、 作用 了解在不同物理条件下，因为酶分子空间构象改变而引发酶特性和功效改变情况探索极端环境中生物生存可能性及其潜力提升酶催化活性，增强酶稳定性，改变酶催化动力学特性第60页第60页二、 物理修饰3、 特点 不改变酶组成单位及其基团，酶分子中共价键不发生改变。只是副键发生一些改变和重排可在一些变性剂作用下，首先破坏酶分子原有空间构象，然后在不同物理条件下，使酶分子重新构建新空间构象第61页第61页第五节结束金属离子置换修饰 物理修饰概念办法作用概念作用特点第62页第62页第五节结束点击返回 第63页第63页第六节 酶化学修饰应用 一、 在酶学研究方面应用二、 在医药方

15、面应用三、 在工业方面应用四、 在有机介质酶催化反应中应用 化学修饰办法不足第64页第64页一、 在酶学研究方面应用 酶活性中心研究 酶空间结构研究 采用含有荧光特性修饰剂，可借助荧光光谱研究，分析各基团在酶分子中空间分布情况 采用巯基修饰剂，可理解酶分子中半胱氨酸数目及分布情况，拟定肽链数目和二硫键数目 酶作用机制研究 理解各种残基及侧链基团在酶催化过程中作用 惯用修饰办法有亲和标识法、差别标识法、氨基酸(核酸)置换法等第65页第65页二、 在医药方面应用 减少或者消除酶抗原性 增强医药用酶稳定性(半衰期延长) 改变组织分布 酶经化学修饰后，能在血液中被靶器官选择性地吸取第66页第66页三、 在工业方面应用 提升工业用酶活力 增强工业用酶稳定性 改变酶动力学特性第67页第67页四、 在有机介质酶催化反应中应用经侧链基团修饰，酶分子能溶解于有机溶剂，均匀分布于溶剂中，提升酶催化效率和稳定性eg. 用MPEG对脂肪酶、过氧化氢酶、