邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠肿瘤组织基因的表达特征研究

1、邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠肿瘤组织基因的表达特征研究卓少元方肇勤卢文丽潘志强梁超吴中华刘小美侯俐张辉廖明娟高必峰【摘要】目的提醒H22荷瘤小鼠邪毒壅盛证肿瘤组织基因表达的特征。方法采用GenehipuseExn1.0STArray等技术及芯片分析方法，观察H22荷瘤小鼠邪毒壅盛、早期气虚、中期阳气虚及中晚期气阴阳虚证肿瘤组织基因表达的差异。结果挑选到邪毒壅盛证独特性高表达的基因32个，其中包括Tte3、Phf7、Ldh等参与睾丸发育、精子或卵子发生的基因22个，Adipq、Nra、Tnfaip6等与肿瘤有关的基因4个，以及Atp8b3、Pnpla3、Retn等其他功能的基因6个。挑选到邪毒壅盛证

2、独特性低表达的基因2个，有rt和L668417。结论邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠肿瘤组织中存在大量独特性表达的基因，可能是该证候与其他证候区别的内在特征。【关键词】肿瘤；证候；同病异证；邪毒壅盛证；基因芯片；小鼠Abstrat：bjetiveTinvestigategenesexpressinprfileinturtissuesfH22ieithbstrutinfevilsyndres.ethdsGenesexpressinintheturtissuesfH22ieithsyndresfbstrutinfevilsyndres,“Qidefiieny,defiienyf“QiandYang,rde

3、fiienyf“QiYinandYang,ereanalyzedbyAffyetrixGenehipuseExn1.0STArray.Results32speialhigher-expressingeneserebserved,inluding22geneshihinvlveintestilegrth,speratgenesisrgenesis,4genesrelatedtturs,and6thergene.Siultaneusly,2speialler-expressingeneserebserved.nlusinNuerusgeneshavespeialexpressinintheturt

4、issuefH22ieithbstrutinfevilsyndres,hihaybeintrinsidifferenebeteenthissyndreand3thersyndres.Keyrds：Tur;Syndre;DifferentSyndrefrthesaedisease;bstrutinfEvilSyndres;Genehip;ie“同病异证和“同病异治是中医理论的特色之一，其内在物质根底是什么，是长期以来被关注和研究的课题。本工程组以往的研究建立起H22荷瘤小鼠常见证候的标准化检测与辨证14，发现随着肿瘤的开展，荷瘤小鼠会自发形成证候并发生演变，早期以邪毒壅盛证和气虚证为主，以后开展

5、为阳气虚证和气阴阳虚证，与人类非常相似5，6。为提醒“同病异证物质根底，我们采用Affyetrix的GenehipuseExn1.0STArray技术，对H22荷瘤小鼠邪毒壅盛证、气虚证、阳气虚证和气阴阳虚证4个常见证候的肿瘤、下丘脑、垂体、肾上腺等组织基因的表达进展了检测。本文重点讨论邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠肿瘤组织基因表达的特征。现报道如下。1材料与方法1.1芯片检测数据的获取采用工程组最近研究获得的4种常见证候荷瘤小鼠肿瘤组织的外显子芯片数据：昆明种小鼠购自上海中医药大学动物实验中心，雄性，体重24g26g，合格证号SXK沪2022-0003，清洁级，腋下接种H22肿瘤腹水癌细胞后，采用

6、小鼠计量化四诊和辨证方法1，挑选出最典型的早期接种后8d邪毒壅盛证和气虚证，中期接种后21d阳气虚证和中晚期接种后29d气阴阳虚证荷瘤小鼠各16只，并分别提取4个不同证候小鼠肿瘤组织RNA，将各证候16个样本合并，采用AffyetrixGenehipuseExn1.0STArray及其方法进展检测。外显子芯片的检测结果有两种输出方式：外显子和核心基因。本文取16661个核心基因进展初步分析7。1.2芯片数据的处理1.2.1相关基因的挑选条件四张芯片中读数至少有一组芯片统计读数以下简称读数大于270的基因该芯片读数均数，以排除那些表达过低者；邪毒壅盛芯片读数与单纯气虚、阳气虚、气阴阳虚等3组比值

7、，大于2.0或小于0.5的基因视为上、下调的基因。1.2.2相关基因信息的挖掘利用互联网上最具代表性、权威性的生物医学文献数据库NBI和清华同方全文数据库NKI等，对符合挑选条件的相关基因进展文献信息挖掘和分析。2结果在芯片的16661个基因中，至少有一组读数大于270的基因有6342个。其中，邪毒组与气虚、阳虚、阴虚3组相比，比值均大于2.0的基因有Tte3、Vd2、ael、Atp8b3、Tuba3和Gst5等32个，而比值均小于0.5的有rtistatin和L668417等2个基因。根据其参与的生物学功能大体上可以分为以下几类。2.1邪毒壅盛证肿瘤组织独特高表达的基因2.1.1参与睾丸发育

8、、精子发生和成熟或卵子发生的基因有Tte3，Phf7，Ldh，Vd2，ael，Fhl4，Tuba3等22个基因，这类基因在早期邪毒壅盛H22荷瘤小鼠肿瘤组织中的表达量都非常高，甚至个别基因芯片读数大于500见表1；在正常小鼠中，这类基因大多数在睾丸组织特异表达，还有少数基因虽在其它组织中也有表达，但以睾丸组织表达程度最高。如Tte3，即T复合体相关睾丸表达3t-plex-assiatedtestisexpressed3基因，它来源于小鼠T复合体区域、并在小鼠睾丸生殖细胞中特异性表达8，在小鼠睾丸中通过与活性很高的酪氨酸激酶2asEinkinase2，K2的调节亚基特异性识别，参与细胞的转化和增

9、殖9；而在很多组织中都有表达Phf7PHDfingerprtein7，在人类和小鼠睾丸组织仅在支持细胞中表达表达程度很高，主要参与精子发生的转录调节10；Ldh基因编码蛋白乳酸脱氢酶4latatedehydrgenase-4，LDH-4是一种仅在哺乳动物睾丸中表达的代谢酶，基因核心启动子含有的G盒-70-65和REAP应答元件，-53-49，-39-35是其在睾丸中完全表达所必需的顺式作用元件11。表1邪毒壅盛证肿瘤组织独特性高表达的参与睾丸发育、精子发生等有关基因略*局部功能给予详细介绍的重要基因2.1.2与肿瘤有关的基因包括Adipq、Nra、Tnfaip6和Pld4等4个基因见表2。这类

10、基因的表达产物是细胞因子、黏附分子或酶类，不仅具有正常的生理功能，还与肿瘤有比拟亲密的关系。如脂联素Adipq是脂肪细胞分泌的一种脂肪细胞因子，具有增加胰岛素敏感性、抗动脉粥样硬化、抑制炎症反响等作用，低脂联素程度可独立增加患子宫内膜癌、乳腺癌、胃癌和前列腺癌等的危险性，脂联素可能具有抗肿瘤活性12；Nra，即神经原相关细胞粘附分子neurn-glia-A-relatedelladhesinleule，在人黑色素瘤和结肠癌细胞和组织中，是-atenin/LEF-1信号途径的一个靶基因，其表达能促进细胞的迁移和肿瘤的发生13可能是通过金属蛋白酶etallprtease介导的NRA脱落的胞外区来实

11、现的14；而肿瘤坏死因子诱导蛋白6Tnfaip6，turnersisfatralphainduedprtein6，又名TSG6，在炎症损伤和卵巢排卵过程中表达上调，表现出抗炎活性、并在雌性生殖中起关键作用15，可作为前列腺癌或癌前期损伤诊断和预后的一个潜在靶标16；Pld4磷脂酶4是G1/S期表达的早期基因之一，可能在细胞生长中起重要作用，Pld4RNA在再生肝中的表达明显高于正常肝脏，并广泛分布于肿瘤细胞如肝细胞瘤hepata和sr转染的细胞中17。2.1.3其他功能的基因有6个，即Atp8b3，Pnpla3，Retn，L380907，Efhd1和Phyhipl。见表3。表2邪毒壅盛证肿瘤组

12、织独特性高表达的与肿瘤有关的基因略*局部功能给予详细介绍的重要基因2.2邪毒壅盛证肿瘤组织独特性低表达的基因这类基因很少，仅有rt和L668417两个见表4。其中，rt的基因产物皮质抑素rtistatin，RT或ST，是一种在构造上与生长抑素satstatin，SRIF非常相似的神经肽，可与所有的生长抑素受体结合，表现出神经元活性受抑等与SRIF共同的特性。但是，它也有许多与生长抑素不同的特性，例如与大脑皮层中乙酰胆碱的兴奋作用相拮抗诱导慢波睡眠、自发活动减少，以及对生长抑素没有反响的阳离子选择性电流的激活等。此外，RT存在于人类内分泌胰腺，可能参与胰岛素和/或胰高血糖素程度的调节18。表3邪

13、毒壅盛证肿瘤组织独特性高表达的其他类基因略表4邪毒壅盛证肿瘤组织独特性低表达的基因略*局部功能给予详细介绍的重要基因3讨论证候的形成有着复杂的物质根底，为此，采用基因芯片这样高效、大通量的检测手段非常必要。为了防止荷瘤小鼠个体的差异，我们采用了标准化的小鼠四诊检测与计量化的辨证方法，并将同一证候最典型的16只小鼠肿瘤RNA样本合并，使芯片检测数据可以较客观地反映出各证候的集中趋势。GenehipuseExn1.0STArray含有16661个基因，面对如此多的基因，如何挑选那些可能具有重要病理意义的基因呢？基于功能重要的基因往往表达量大的生物学特点，我们取所有芯片读数均数270作为入选标准，在

14、4个组别中一致小于该均数者放弃，希望能首先关注那些表达量较大者。邪毒壅盛是H22荷瘤小鼠早期一个常见的证候，突出表如今肿瘤增长迅速、小鼠死亡率高、预后差，与同期的气虚证有很大的区别，是典型的同病异证6，7。是哪些基因表达的改变导致了这种证候的发生，并使得肿瘤增长如此迅速？通过对4张不同证候肿瘤芯片读数的分析，我们看到，与其他3种证候相比，在邪毒壅盛证荷瘤小鼠肿瘤组织独特性表达的34个基因中，有32个基因表达升高，其中竟有22个以往的研究发现与睾丸发育、精子发生和成熟或卵子发生等有关，这些基因不仅数目众多，而且表达量大。邪毒壅盛证H22荷瘤小鼠肿瘤组织有如此多的参与发育生殖的基因，这还是首次被观

15、察到。通过文献检索我们还发现高表达基因中包括有细胞因子或粘附分子类基因，或多或少与各种肿瘤有着亲密的关系，具有共性。这些基因在邪毒壅盛证小鼠肿瘤表达独特，很可能是该证候小鼠肿瘤快速增长、并导致该证候与其他证候差异的关键物质根底之一。该结果还提示，不管是邪毒壅盛证，还是其他证候，确实存在着独特性表达的基因，有规律可循，并可能是中医证候理论复杂内涵的一角。因此，本研究为进一步认识“同病异证的物质根底以及我们今后深化的研究奠定了基矗【参考文献】1方肇勤.辨证论治实验方法学实验小鼠诊法和辨证,第1版.上海：上海科学技术出版社,2022:132.2方肇勤,潘志强,付晓伶,等.小鼠四诊采集工程标准的建议J

16、.中国中医根底医学杂志,2022,11(9):692.3方肇勤,潘志强,汤伟昌,等.小鼠四诊工作站构建与操作标准讨论J.上海中医药大学学报,2022,20(1):42.4方肇勤,潘志强,卢文丽,等.小鼠常见证候的辨证标准J.中国中医根底医学杂志,2022,12(7):508.5方肇勤,潘志强,陈晓.实验小鼠四诊方法学的创立和意义J.上海中医药大学杂志,2022,40(7):1,封3.6方肇勤,侯俐,卢文丽,等.荷瘤小鼠证候的发生、演变、兼证及预后J.上海中医药杂志,2022,41(1):57.7方肇勤,卢文丽,潘志强,等.不同证候荷瘤小鼠神经-内分泌-免疫网络基因转录的特征J.中华中医药杂志,

17、2022，(增刊):8.8RappldGA,TrsdaleJ,LihterP.Assignentfthehuanhlgueftheuset-plexgeneTTE3thuanhrse6q27J.Genis.1992Aug;13(4):1337.9BaiX,hanED,XuX.TheprtEinfanegene,Ttex4,interatsithprteinkinaseK2betasubunitandishighlyexpressedinusetestisJ.BiheBiphysResun，2022Jul18;307(1):86.10XiaJ,Xu,LiJ,etal.NYD-SP6,anvelg

18、eneptentiallyinvlvedinregulatingtestiulardevelpent/speratgenesisJ.BiheBiphysResun，2002，291(1):101.11TangH,KungA,GldbergE.Regulatinfurinelatatedehydrgenase(Ldh)geneexpressinJ.BilReprd.2022ar;78(3):455.12陈仲.脂联素蛋白的纯化方法及卵巢癌ES-2体外抑瘤活性研究D.中国协和医科大学硕士学位论文.2022：7.13nai-SrrellE,Ben-YedidiaT,Shtutan,etal.Nr-Aisatargetgenefthebeta-atenin/LEF-1pathayinelanaandlnaneranditsexpressinenhanestilityandnfersturigenesisJ.GenesDev.2002Aug15;16(16):2058.14nai-Srrell,KaplanA,RavehS,etal.TheshedetdainfNr-Astiulat