酶动力学及抑制剂第一讲1

1、酶动力学及抑制剂Enzyme kinetics and Inhibitors 田维熙 教授中国科学院大学第一讲 酶的反应动力学主讲教师：田维熙，中国科学院大学生命科学学院退休教授，博士生导师。中国科学院研究生院1978级研究生，师从邹承鲁院士，主攻酶学。 80年代曾在美国做访问学者及博士后研究。从事酶动力学及脂肪酸合酶的作用机理、结构与功能、抑制剂及其在减肥、抑癌中的应用等方面的研究，和酶学教学工作。曾获国家自然科学奖，北京市科学技术奖，中科院自然科学奖，宝钢优秀教师奖等奖项。手机： Email: 助教：黄文元本课程的内容和要求本课程内容包括五讲： 第一讲，酶的反应动力学 第二讲，酶的抑制作用

2、动力学 第三讲，pH影响的酶反应动力学和抑制作用动力学 第四讲，酶抑制剂和酶动力学在生物医药研究中的应用。 第五讲，酶的功能基团的定性和定量的实验判定。酶动力学是在生物、医药、农业、环境等领域的研究和开发中仍在应用的传统理论和技术。搞清基本概念，理解基础理论，掌握研究方法。教学参考资料R. A. Copeland. Enzymes, 2nd Ed. Wiley-VCH, Inc., 2000讲义：田维熙 酶动力学，酶的功能基团及抑制剂，2011年修订以上参考资料均通过课程网站提供电子版。考核：2次课外练习30分，最迟在最后一次课结束时交；最后50分钟课堂开卷考试70分。一、酶动力学研究什么？区

3、分kinetics （研究定量）和 dynamics（研究动态）酶动力学是对酶催化反应速度和过程的定量研究。a 研究酶催化反应速度和底物浓度的定量关系。b 研究外部因素，如环境pH值、抑制剂和激活剂等对催化反应速度影响的定量规律；以及其定量规律和作用机制的关系。c 研究酶反应中由底物到产物的作用机制历程：由反应速度的定量研究确定底物、产物加入和放出，以及复合物的形成、形式及转换的过程。通过这些研究可以了解酶的作用机制，功能基团，抑制剂等，并给出定量指标和评价。二、化学动力学的反应级数0级到3级反应的速度和作用物浓度的关系0-2级反应的速度方程和产物方程酶反应符合饱和动力学Saturated K

4、inetics酶催化反应的特点是什么？酶催化反应的特点是底物首先要可逆结合在酶上特定部位，再发生催化反应： E + S ES E + P这使反应速度取决于ES浓度，而不是直接取决于底物浓度。原始酶浓度成为ES浓度上限，使得S浓度增加到一定程度后出现“饱和”现象。凡是先可逆结合，再不可逆变化的过程，都会表现出饱和动力学的特征。饱和动力学的时间过程和稳态概念E + S ES E + P稳态：在饱和动力学中，ES浓度保持不变，从而反应速度保持不变的一段状态。（steady state）稳态前是一段很短的时间过程，大多数酶反应的稳态前不到1秒。达到稳态时ES的生成速度和分解速度相等，ES浓度不变，反应

5、速度不变。但稳态不是平衡态，反应物和产物的浓度都在变。酶活性测定的是稳态时的反应速度，也称为酶反应的初速度。一般酶动力学研究是在测定酶反应稳态速度基础上开展的，是酶的稳态动力学。另有稳态前动力学:Transient kinetics三、米氏公式单底物单产物酶反应推导要点1. 利用三点设定，由稳态出发建立初步关系式。2. 利用总酶浓度为各个酶形式浓度之和代入初步关系式。3. 推导方向为导出ES/ET表达式。该表达式即为v/Vm表达式。4. 适当定义Km。这是推导酶动力学速度方程时普遍适用的要点。动力学参数微观动力学参数：反应过程中每一个具体步骤的正向和逆向速度常数。如本例中的k1, k-1。宏观

6、动力学参数：反映反应总体情况的动力学常数。如本例中的Km, Vm。Vm ：最大反应速度。表现催化步骤的快慢。 Vm = k2ET, k2又称kcat，或转换数。Km ：达到最大反应速度一半时所需的底物浓度。表现底物在酶上结合紧密程度的大小。米氏常数 Km以v = Vm/2 代入米氏公式： Vm/2 = Vm S/(Km+S) Km+S = 2S，Km = SKm值越小，表示达到最大反应速度一半（一半酶被底物结合）所需的底物浓度越低，即底物在酶上亲和力越高。但Km不是解离常数。解离常数KS=k-1/k1 只有k2k-1时，近似地Km=KS。kcatVm的缺点：和酶浓度有关，不是本质上的常数。 k

7、cat = Vm/ET，消除了酶浓度的影响。计算kcat时注意Vm和ET要摩尔化的单位。kcat是一级速度常数，单位为min-1或sec-1，即单位时间里1个酶分子能生成的产物数，即反应次数，又称为转换数turnover number 。由于使用上的方便，目前Vm仍得到应用。一般纯理论研究中较多用kcat ，其它研究中较多用Vm 。kcat反映的过程包括 ES EP E+P，所以不是本质上的微观动力学常数。kcat /KmKm和kcat分别体现了酶反应结合步骤和催化步骤的动力学特性。当S Km时，米氏公式简化为： V = VmS / Km = (kcat / Km) ETSkcat / Km是

8、酶反应的表观二级速度常数，可以用来衡量酶的催化功能，用做比较酶的催化能力指标。四、米氏公式的双倒数作图由米氏公式两侧同时取倒数，得到：以1/v vs. 1/S 作图为直线。直线的斜率为Km/Vm，纵轴截距为1/Vm。由此作图的斜率和纵轴截距即可算出Km和Vm。进而可由Vm和酶浓度得到kcat 。Lineweaver-Burk Plots （双倒数作图）米氏方程还有多种作图。较常见有Hanes-Wolff 作图：在双倒数的公式两侧同乘S，得到以下公式：以S/v vs. S 作图为直线。还有Eadie-Hofstee作图：双倒数公式两侧同乘Vm，得到Vm/v = 1 + Km / S，再两侧同乘v

9、，移项得到：v = Vm - Km v/S以v vs. v/S 作图为直线。但双倒数作图是最主要的、最常用的作图。五、单底物酶反应速度方程的一般形式如果不设定初速度，即需要考虑生成产物的逆反应时，如下式： k1 k2 S + E ES E + P k-1 k-2 v = k2 ES - k-2 EP （1） 由稳态： dES- = k1 ES + k-2 EP - k-1 ES - k2 ES dt = (k1S + k-2P) E - (k-1 + k2)ES = 0 （2） 将 ET = E + ES 代入（2）式： (k1S + k-2P) (ET - ES) - (k-1 + k2)E

10、S = 0 (k1S + k-2P)(ET ) = (k-1 + k2 + k1S + k-2P) ES (k1S + k-2P)ET ES = - （3） k-1 + k2 + k1S + k-2P ET = E + ES代入（2）式还可得： (k1S + k-2P)E = (k-1 + k2 ) (ET - E)整理得： (k-1 + k2 ) ETE = - （4） k-1 + k2 + k1S + k-2P（3），（4）式代入（1）式： (k1k2S + k2k-2P)ET - (k-1k-2P + k2k-2P) ET v = - k-1 + k2 +k1S + k-2P k1k2S

11、ET k-1k-2PET v = - （5） k-1 + k2 + k1S + k-2P （5）式为单底物酶反应速度方程的一般形式。当设定初速度，P = 0， （5）式简化为 k1k2 ETS VmS v = - = - （6） k-1 + k2 +k1S k-1 + k2 - + S k1即为米氏方程。 六、实验设计及操作基于双倒数作图的实验是动力学测定的基本方法。这是因为： 1）利用数学方法的研究表明双倒数作图法是各种作图法中计算参数准确性最好的。 2）基于双倒数作图已导出了一系列动力学作图判断的规则，并已广泛应用。至今酶动力学基本实验测定绝大多数是基于双倒数作图来设计的。双倒数作图法的实验设计1）基本方法：选择几个不同底物浓度，分别测定酶反应速度，以1/v对1/S作图。2）底物浓度选择：一般4-6个浓度，在Km上下，适当偏选较大浓度。避免多数浓度处于一级区和0级区。（无底物抑制条件下）3）在技术上可行的条件下拉开浓度间隔，且低浓度小间隔，高浓度大间隔。4）酶浓度适中。操作注意点1）关注实验条件：包括温度、pH、缓冲液浓度、保护剂等。2）关注仪器条件及状态：如恒温状态、波长、比色杯选择、光源。3）选择好加样工具：原则上大影响样（如酶、低浓度底物）用精确工具，小影响样用