高效液相色谱法 PPTPPT

1、关于高效液相色谱法 PPT第一张，PPT共三十四页，创作于2022年6月216-1 高效液相色谱法的特点1. 特点：高压、高效、高速、自动化 与气相色谱比较：适合于分子量大、高沸点、热不稳定有机及生化试样， 离子型化合物和高聚物的分离分析。液体流动相参与分离过程，选择性高。固定相类型多，分析选择余地大。较低的柱温，有利于色谱分离。液体扩散性小，纵向扩散可忽略。试样易于制备及回收。仪器复杂昂贵。第二张，PPT共三十四页，创作于2022年6月液相色谱高柱效的原因:以特殊方法用小粒径的填料（35um球形）制备色谱柱H=He+Hd+Hm+Hs+Hsm =A+B/u +Cmu+Csu+Csmu 由于溶质

2、分子在溶剂中的扩散系数很小，纵向扩散可以忽略。 因此B项可以略去。H=A+（Cm+Cs+Csm）uA=2dp 2.液相色谱中速率理论0.01 k2 (1+ k)2 Cm =dp2 Dm 第三张，PPT共三十四页，创作于2022年6月416-2 高效液相色谱仪流程及主要部件流程组成系统：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测和记录系统第四张，PPT共三十四页，创作于2022年6月516-2-1 高压输液系统（1） 高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚

3、 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小) 溶剂强度指溶剂将组分从色谱柱上洗脱下来的能力。溶剂强度与溶剂的极性有关。正向色谱中溶剂极性越大溶剂强度越大。反相色谱反之。 第十六张，PPT共三十四页，创作于2022年6月17（2）溶剂要与检测器匹配。对于紫外吸收检测器，应注意选用检测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。 对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达最高灵敏度。（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长值增加501OOnm。（4）化学稳定性好。避免

4、与样品或固定相发生反应或聚合。（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。（6） 试样在流动相中应有适宜的溶解度，若试样组分的分配比K值范围很广，则采用梯度洗脱。第十七张，PPT共三十四页，创作于2022年6月18一、液-固吸附色谱二、液-液分配色谱三、化学键合相色谱四、离子交换色谱五、排阻色谱六、亲和色谱(AC)主要分离类型与原理第十八张，PPT共三十四页，创作于2022年6月1916-3 液-固吸附色谱liquid-solid adsorption

5、chromatography 固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；第十九张，PPT共三十四页，创作于2022年6月2016-4 液-液分配色谱liquid- liquid partition chromatography 固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流

6、动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：（1）全多孔型载体 （2）表面多孔型载体（薄壳型微珠担体） （3）固定液 极性：，-氧二丙腈，聚乙二醇 非极性：十八烷（ODS），角鲨烷 第二十张，PPT共三十四页，创作于2022年6月2116-5 化学键合相色谱bonded-phase chromatography1键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶。利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分子成键,即可得到各种性能的固定相。一般可分三类（1）疏水基团 如不同

7、链长的烷烃（C8和C18）和苯基等（2）极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基，季铵盐； 作为阳离子交换 基团的磺酸等.第二十一张，PPT共三十四页，创作于2022年6月22C18硅胶填料结构第二十二张，PPT共三十四页，创作于2022年6月2316-5 化学键合相色谱bonded-phase chromatography 2.化学键合固定相特点：（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；（3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度

8、洗脱；适用于分离容量因子k值范围宽的样品。存在着双重分离机制：(键合基团的覆盖率决定分离机理)高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；第二十三张，PPT共三十四页，创作于2022年6月243反相健合相色谱法 固定相：极性较小的键合固定相，如硅胶-C18H37、硅胶-苯基等；流动相：极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛-水、水和无机盐的缓冲溶液等。多用于分离多环芳烃等低极性化合物；具有柱效高，能获得无拖尾色谱峰的优点。分离机理：疏溶剂作用。把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有较强的疏水特性。当用极性流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时，一方面，分子中的

9、非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。第二十四张，PPT共三十四页，创作于2022年6月254.正相键合相色谱法 固定相:极性的有机基团，CN、NH2双羟基等（表16-4）键合在硅胶表面；流动相:而以非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等）为分离极性化合物。主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用于分离不同类型的化合物。5.离子性键合相色谱法 固定相:当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，化学键合

10、各种离子交换基团，如一SO3H 一CH2NH2、C00H、一CH2N（CH3）等； 流动相:一般采用缓冲溶液。 分离原理与离子交换色谱类同。第二十五张，PPT共三十四页，创作于2022年6月2616-6 离子交换色谱ion-exchange chromatography 流动相：阴离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；阳离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH +X- =

11、RNR4 X + OH- 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。第二十六张，PPT共三十四页，创作于2022年6月27离子交换色谱分离固定相 结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团） 树脂类别（表16-6）：（1） 阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2） 阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）第二十七张，PPT共三十四页，创作于2022年6月2816-7 排阻色谱色谱size- exclusion chromatography 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大

12、小分离。小分子可以扩散（渗透）到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离 第二十八张，PPT共三十四页，创作于2022年6月29 空间排阻分离固定相（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响

13、小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。第二十九张，PPT共三十四页，创作于2022年6月3016-8 亲和色谱(AC) Affinity chromatograph原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。第三十张，PPT共三十四页，创作于2022年6月31分离类型分离原理固定相流动相应用对象液-固吸附色谱固定相上吸附解吸硅胶、氧化铝等固体吸附剂不同极

14、性的一元或多元溶剂。不同官能团的化合物和异构体液-液分配色谱在固定相和流动相上分配多孔型载体+极性或非极性固定液与固定液极性相反分析各种不同性质的物质化学键合相色谱反相健合与固定相缔合、解缔作用硅胶键合非极性固定相甲醇、乙睛-水、缓冲溶液等分离同系物、多环芳烃等正相健合在固定相和流动相上分配硅胶键合极性固定相非极性或极性小的溶剂分离异构体，极性不同的化合物离子健合反复离子交换反应硅胶键合离子交换基团缓冲溶液离子化合物或有机酸碱离子交换色谱反复离子交换反应载体表面涂覆离子交换树脂酸或碱溶液离子化合物或有机酸碱、生物物质排阻色谱色谱按分子大小分离。凝胶(具有一定大小孔隙分布)缓冲液或有机溶剂大分子物质、测量相对分子量第三十一张，PPT共三十四页，创作于2022年6月3216-9 色谱分离方法的选择第三十