中大生化与细胞实验方法

1、细胞生物学实验方法与技术当前细胞生物学与事业联系的较为紧密的热点问题主要有以下几种：1）真核细胞结构及其表达调控；2）细胞膜、膜系、受体与信号传递研究；3）的研究；4) 细胞工程，细胞生长、分化、衰老、，尤其是程序性细胞包括工程及体细胞核移植的研究。一、细胞培养常用方法1、细胞原代培养（primay culture） 又称初代培养，即直接从机体取下细胞、组织、或、让他们在体外维持与生长。原代细胞的特点是细胞或组织刚离开机体，他们的生物状态尚未发生很大的改变，一定程度上可反映他们在体内的状态，来源组织或细胞的特性，因此用于药物实验尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒性或作用等研究是极好工具。

2、常用的原代培养方法有组织快培养法及消化培养法。前者方法简单，细胞也较易生长，尤其是培养心肌有时能观察到心肌组织块的搏动。细胞从组织块外长并铺满培养皿或培养瓶后即可进行传代。2、细胞的传代培养当细胞生长至单层汇合时，便需要进行分离培养否则会因无繁殖空间、营养耗竭而影响生长，甚至整片细胞脱离基质悬浮起来直至。为此当细胞达到一定密度时必须传代或再次培养，目的是借此繁殖的细胞，另一方面是防止细胞的。二、培养方法培养（an culture）是指用特殊的装置使、原基或它们的一部分在体外存活，幷保持其原有的结构和功能。培养可模拟体内的三维结构，用于观察组织间的相互反应、组织与细胞的分化以及外界因子包括药物对

3、组织细胞的作用。培养方法很多，最经典的方法即表玻皿培养法；一种最常用的方法是不锈钢金属网格法及 Wolff 培养法和扩散盒培养法，实验者可根据情况选择采用。三、放射自显影术测定放射自显影术（autoradiography）是利用放射性同位素电离辐射对核子乳胶的感光作用，显示标本或样品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在紧密接触的感光乳胶中下它存在的部位和强度，准确显示出形态与功能的定位关系。现已可将放射自显影术与电镜以及生物分子结合起来。不但可以研究放射性物质在组织和细胞内的分布代谢，而且可以揭示核酸及其损伤等改变，目前已在生命科学各领域被广泛应用。四、分析技术染色质或是遗传物

4、质在细胞水平的形态特征。前者是指当细胞处于期时遗传物质经碱性后，呈现出细丝状弥漫结构；当细胞进入期时，染色质细丝高度螺旋化凝聚为形态有特征的。特别是在中期，后的达到最高程度的凝聚，称为中期染色，是进行形态观察分析的最佳时分析应用领域越来越广，主要用于以下几方面：1）为临床期。提供新；2）研究不育和发生的遗传基础；3) 通过检查性的，预防有异常患儿出生（愚型）；4）根据的多肽性进行亲子和异型配子的研究；结合 DNA 重组技术可以将定位于的具体区带上。五、电镜技术早在 1940 年，英国实用价值。1965 年英国大学首先试制成功扫描电子显微镜，但因分辨率低无科学仪器开始生产出商品扫描电镜，其以显著

5、优点广泛用于生物学、医学、物理学、化学、电子学及勘探、冶金、国防、机械与轻工业等诸多领域，并已成为非常有用的研究工具。电镜主要特点：1）景深大，较光学显微镜大几百倍；2）图像富有感，是图象；3）图像放大范围大，光学显微镜有效放大一个实感的三维结构倍数为 1000 倍左右，电镜的放大倍数为几百倍至 100 万倍，扫描电镜可放大十几倍至几十万倍；4）分辨率高，扫描电镜可达 63nm；5）样品可在三度空间平移和旋转，聚焦后可以任意放大倍数，而不需调整重新聚焦。六、细胞、细胞器、及细胞间质的分离技术、1、 细胞的分离分离不同的细胞及亚细胞组分在现物学研究中起着重要的作用。如研究某种药物治疗白血病的机理

6、，需要分离培养人或动物的骨髓细胞，观察药物的细胞作用；研究与细胞生长分化有关的生长因子的作用，需将与此类因子有关的细胞分离出来；分离细胞膜，线粒体等细胞的亚组分，对于研究信号传递，某些遗传疾病，也都是必不可少段。2、细胞膜的分离细胞内的膜系统与细胞质膜统称为生物膜（biomembrane）,他们都有共同结构和特征。首先要分离出形状完整的、具有生物活性的、高纯度的细胞膜，用于研究细胞膜的结构和功能，以利于观察膜在细胞与环境进行能量交换及信息传递的过程。3、细胞核的分离细胞核作为一个功能，完整的保存遗传物质，幷指导RNA，后者为蛋白质及其它细胞组分所必需。因此细胞核分离是研究表达及细胞核形态结构的

7、首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后，用分级离心或超声波处理等方法进行纯化。4、溶酶体的分离溶酶体是处理细胞吞噬物的细胞器，含有高浓度的各种水解酶类，调控细胞内的消化过程。溶酶体的分离常用于研究因溶酶体功能缺陷而引起的多种疾病。5、线粒体的分离线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需要的能量，主要由粒体内进行氧化所产生的能量供给。线粒体关键是保持其完整性及高纯度。6、细胞 DNA、RNA 分离与纯化核酸是遗传信息及表达的物质基础。核酸的提取与纯化关键是保持核酸的完整性，但较，主要因为：一是细胞内有活性很高的核糖核酸酶；二是酸碱等化学；三是高温机械损伤等物理，需严格遵守操作规程。七、细胞凋亡研究

8、方法细胞凋亡(apoptosis),又称为程序性（programmed cell death,PCD）指的是有核细胞在一定条件下，通过激活其自身机制，尤其是开启与关闭某些以及内源性 DNA 内切酶活化，导致产生细胞自然性的过程。可以认为细胞的这种方式是一种生理性的自发过程。为此有人也称其为细胞。目前认为程序性几乎和细胞的增殖同样重要，如果没有细胞凋亡，不能形成与存活，或者发生疾病。只有通过细胞凋亡的发生，使特定细胞群体在特定的时间和特定的部位。从而使机体在总体上保障其细胞数量，以及形态与功能的平衡。近年来如何用药物诱导癌细胞也成为细胞凋亡的热点之一。电镜观察是研究细胞凋亡的首选方法。八、原位杂

9、交原位杂交技术是将分子杂交与组织化学相结合，用标记的DNA 或RNA 为探针，在原位检测组织细胞内特异互补的 DNA 或 RNA 序列。它分为三类：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA。已广泛用于生物学的各个领域。原位 DNA 末端标记可以用于细胞凋亡的定量研究。原位杂交技术和 PCR 技术结合用于检测人瘤（HPV）九、单克隆抗体是 1975 年被描述的一种可产生无限量，并可其性质的抗体技术。该技术的关键步骤在于淋巴细胞之间的融合，所以称为“淋巴细胞杂交瘤技术”；由于杂交瘤经过筛选可产生针对单一抗原决定簇抗体的细胞克隆，故称为单克隆抗体技术。该技术的问世使得免疫学研究与实践发生了性的改观，同时还为生物学和学的许多领域提供了前所未有的研究工具。人们利用其可精确地识别出极为复杂的分子，测定出无法测定的物质，识别出新的细胞群体，揭示了以往未曾了解的细胞分化途径，为肿瘤、性疾病、自身免疫性疾病等的和治疗创造出令人兴奋的前景。十、神经细胞培养神经细胞培养是指从体内取出某一种神经组织，在无菌、适当温度和一定营养条件下模拟在体生理环境，使之存活和生长，幷保持其结构和功能。神经细胞培养按培养前切割程度分为培养、组织快培养和细胞分离培养。1、培养 （an culture ） 是切割最少型的培养。全或大片放在保温的营养液中可保存数日。这类培养切断了正常的，的营养交换