蛋白质的分离与纯化重组蛋白质表达分离与纯化技术讲座

1、蛋白质的分离与纯化重组蛋白质表达分离与纯化技术讲座蛋白质(Proteins)蛋白质是一切生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成。氨基酸人类一共有20种常见的氨基酸，它们的排列组合形成了人类绝大多数的蛋白质。氨基酸链组成的蛋白质蛋白质是由氨基酸分子呈线性排列所形成，相邻氨基酸残基的羧基和氨基通过肽键连接在一起。我们为什么要纯蛋白质生命科学研究：蛋白质的结构功能，以及其在生理以及病理学的意义；工业或者治疗：比如血液制品人血白蛋白，以及从猪胰脏中获得的胰岛素制剂；用于药学研究等，比如能够使一些细菌产生的抗性的蛋白；

2、生物体如何合成蛋白质我们知道蛋白质虽然结构变化多端，但其实由20种氨基酸以特定的序列组成。但这个序列又从何来？近代分子生物学发现，绝大多数蛋白质序列都是脱氧核糖酸DNA编码的，但无论是人类，高等动物，高等植物还是细菌。即称为中心法则(Genetic Central Dogma)AAADNAUUURNAPheProtein苯丙氨酸生物体的中心法则中心法则(Genetic Central Dogma)： 是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质的转录和翻译的过程，以及遗传信息从DNA传递给DNA的复制过程。DNA复制DNA转录RNA翻译Central Dogma of Molecu

3、lar BiologyProposed by Francis Crick, 1958细胞内的蛋白质合成如何获得蛋白质？天然蛋白从动植物组织中得到天然状态的蛋白有机化学合成重组蛋白利用基因工程方法在宿主中表达的外源性蛋白。利用有机化学的方法合成，多数只能合成55个氨基酸以下的肽链重组蛋白表达中心法则告诉我们：既然蛋白质的全部氨基酸信息都包含在DNA序列中，所以我们可以利用DNA来合成蛋白。我们可以利用宿主的中心法则系统，合成包括一些宿主本来根本不存在的蛋白，即重组蛋白。DNA复制DNA转录RNA翻译重组蛋白表达大致过程包括基因获取以及构建，宿主的转化或者转染，以及最后的蛋白质收集。基因获取基因克

4、隆宿主转化蛋白获得原料准备蛋白合成启动重组蛋白表达1. 原料-需要有正确而且完整的编码蛋白质的DNA的序列；2. 工厂-需要有将DNA转录翻译的宿主系统，并处于正常工作中，将DNA序列正确加工成蛋白质产品；常用的重组蛋白表达体系原核体系（工程杆菌-改造大肠杆菌）；昆虫体系（天蚕蛾sf9,high5细胞）；哺乳动物体系：（仓鼠卵细胞CHO，人囊胚肾细胞Hek293等）；CHO细胞-赢润细胞库工程杆菌-赢润基因库为何选原核表达为什么选大肠杆菌做原核系统的蛋白质表达？容易克隆与基因改造；生长迅速，表达快速；培养容易而且非常廉价；大肠杆菌菌落-固像培养大肠杆菌菌液-液像培养适应大肠杆菌中心法则保证DN

5、A不被降解能够随着细菌的增殖而同时被扩增（可复制）；保证质粒在在细菌生长时不能丢失（不丢失，不出错）；能够正确被大肠杆菌宿主翻译体系识别得到翻译正确蛋白质（可转录）。载体载体能够承载靶蛋白的DNA序列，并使该基因的转录和翻译完全能配合宿主系统，即被大肠杆菌识别。同时保证靶蛋白的基因序列可扩增，可复制，可表达。原核表达载体一般构架复制启动子Ori，保证质粒在细菌中复制（可复制）抗生素抗性基因，生长抗性压力下的细菌必须拥有质粒（不丢失)转录起始，核糖体结合位点Figure 1: Diagram of the pGEX expression vector.pGEX-系列载体同样拥有启动子Ori（可复

6、制）抗性基因（不丢失）及转录lac基因（可转录）。常见的原核表达载体pGEX系列，包括pGEX-KG,pGEX-4T-2等pET系列，包括pET-15b，pET-22a，pET-42a等；pDESTpMAL系列；pBAD系列：常见的原核载体pTYB1，pMAL, pET28-b，pET-20b(+)，pRSFDuet-1，pRset-a ，pGEX-4T-2，pGEX-KG，pQE9, pBAD-his等原核表达载体，能够满足各种不同的需求。如果有兴趣了解更多原核载体可以查询：赢润载体库: :/如何得到更高效表达高效的噬菌体RNA聚合酶以及噬菌體启动子何谓噬菌体噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或

7、螺旋体等微生物的细菌病毒的总称。T7噬菌体其能够侵染大肠杆菌，并快速的在大肠杆菌中进行复制，并利用大肠杆菌高效的表达自身的蛋白，而抑制大肠杆菌自身的蛋白质合成。T7噬菌体T7噬菌体侵染大肠杆菌后，可以看到大肠杆菌自身的蛋白质表达完全停滞。噬菌体浸染大肠杆菌的时间噬菌体高效表达自身蛋白原因T7启动子活性非常高；噬菌体的转录活性非常高，拥有特定的DNA序列；因此两者结合，能够达到高效表达蛋白。因此Novagen公司就开发出一系列的pET(T7)系列的载体。这个体系有时候重组蛋白都可以达到细菌自身的一半以上。细胞分离提纯分离原料从何处来?我们需要的特定蛋白如何与其它杂质分离？分离得到粗蛋白之后，我们

8、如何进一步提纯？蛋白质分离纯化流水过程得到含有重组蛋白的细胞之后，我们如何从中得到蛋白？细胞裂解细胞裂解是为了将含有重组蛋白的分成释放到可溶性的溶液中；常用方法：反复冻溶超声仪破碎；碾磨破碎；如何分离与捕捉蛋白？目的蛋白留下含有10000种蛋白的粗提物其它无关蛋白弃去蛋白表面正电荷差异蛋白表面负电荷差异蛋白表面疏水性差异蛋白分子量大小差异蛋白表面亲水性差异特定的亲合能力差异性质差异分离蛋白蛋白质的捕捉为了从液像中捕获蛋白，我们通过固象的琼脂糖(sepharose)介质偶联特异性基团，就可以制成不同性质的纯化填料，捕捉不同特性的蛋白质。疏水层析包括疏水层析(Phenyl-SepharoseTM6

9、FastFlow)，蛋白表面疏水性差异阴阳离子交换层析包括Q阴离子交换，以及SP阳离子交换层析蛋白表面正电荷差异蛋白表面负电荷差异Q阴离子交换SP阳离子交换阴阳离子交换层板洗脱目的蛋白质阴阳离子交换层析分子量大小分离蛋白质分子筛可以用于分离分子量大小不同的蛋白质亲合层析通过特異性的标签肽或蛋白，包括GST,His，使得目的蛋白能够与蛋白柱特异性的结合。washporousbeadglutathioneeluteGSTapply samplethrombin siteprotein of interestExample: GST - GlutathioneGST-tagged proteins

10、bind to gluthatione on beadsNon-specifically or weakly bound proteins washed offGST-tagged proteins eluted with glutathione (competitor) or thrombin (protease)GST亲合层析利用蛋白特性亲合纯化如NADPH偶连的层析柱能够捕捉NADPH结合的蛋白质；如钙磷ATP柱能夠特異性的捕捉與ATP结合的蛋白激酶；金黄色葡萄球菌蛋白Protein-A可以特异性的结合抗体，并用于抗体蛋白的分离与纯化。三种蛋白质层析的检测Protein mixture applied to columnSolvent (buffer) applied to top, flowed through column Different pro