培养基灭菌讲稿

1、关于培养基灭菌第一张，PPT共六十八页，创作于2022年6月培养基灭菌程度N / N0培养基灭菌程度的要求因发酵系统而异。 某些培养过程，由于培养基中的基质不易被一般微生物利用,或温度、pH不适于一般微生物的生长，则对无菌程度要求低；但是有一些培养过程对无菌程度要求高，例如抗生素的生产过程。第二张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第一节 分批灭菌一、微生物的热死灭动力学 对培养基进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡（微生物体内蛋白质变性）的速率与残存的微生物数量成正比。 ln(N/N0 ) = -K t均相系统，它符合化学反应的一级反应动力学。第三张，PPT共六十八页，创作于2022

2、年6月K（比热死亡速率常数）由两个因素均定1、微生物的种类2、灭菌温度。第四张，PPT共六十八页，创作于2022年6月 ln(N/N0 ) = -K t ln(C/C0 ) = -Kd t杂菌营养物质T ， K， Kd也就是K对T的变化率是怎么样的？第五张，PPT共六十八页，创作于2022年6月灭菌动力学的重要结论 细菌孢子热死灭反应的E很高，而大部分营养物质热破坏反应的E很低，因而将T提高到一定程度会加速细菌孢子的死灭速率，从而缩短在升高温度下的灭菌时间（ ln(N/N0 ) = - K t ）；由于营养成分热破坏的E很低，上述的温度提高只能稍微增大其热破坏温度，但由于灭菌时间的显著缩短，结

3、果是营养成分的破坏量在允许的范围内。第六张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第一节 分批灭菌二 分批灭菌的设计1、分批灭菌的操作 将配好的培养基打入发酵罐，通入蒸汽将培养基和所用的设备一起进行灭菌，也称实罐灭菌。优点：（1）不需专门的灭菌设备。（2）对蒸汽的压力要求较低，在34105Pa（表压）就可满足要求。缺点：在灭菌过程中，蒸汽用量波动大，造成锅炉负荷波动大。 第七张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第一节 分批灭菌 二 分批灭菌的设计1、分批灭菌的操作 第八张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第九张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第十张，PPT共六十八页，创作于

4、2022年6月第十一张，PPT共六十八页，创作于2022年6月高压蒸汽锅第十二张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第一节 分批灭菌 二 分批灭菌的设计2、分批灭菌的设计 要求绝对的无菌在工业上很难做到，因为： N=0，则e-kt= 0, 1/ekt= 0, ekt=, t= 因此，绝对的无菌很难做到。第十三张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第一节 分批灭菌 二 分批灭菌的设计 而且绝对的无菌也是不必要的，工程上只要求培养基中杂菌降低到合理的程度，然后进行细胞的培养，失败的可能性很小。 那么无菌程度降低到多少为好呢？ 有一个设计标准（判据）N0：未灭菌培养基的含菌数。N：灭菌后培养

5、基中存活的菌体数， 第十四张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第一节 分批灭菌 二 分批灭菌的设计常取N=10-3个/罐。它的意义是：灭菌103次，存活一个活菌孢子的机会为1次。例如：培养基100m3，含菌105个/ml,，要求灭菌后存活菌数10-3个/罐= 那么为计算方便 Ln（N0/N ）= 36.8 第十五张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第一节 分批灭菌 二 分批灭菌的设计分批灭菌过程：升温、保温和降温，灭菌主要是在保温过程中实现的，在升温的后期和冷却的初期，培养基的温度很高，因而对灭菌也有一定贡献。第十六张，PPT共六十八页，创作于2022年6月T 灭菌温度tot1t2

6、t3timeN1N2N升温保温降温N0Ln(N0 / N1)Ln(N2 / N)Ln(N1 / N2)Ln N0/N =36.8是总的判据，是由升温、保温、降温三段实现的ln （N0/N） =ln（ ） ln N0/N =ln +ln+ln第十七张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第一节 分批灭菌 二 分批灭菌的设计 在灭菌过程中，必需设计出灭菌过程的操作时间和温度。 首先根据培养过程对培养基无菌程度的要求提出无菌判据（ln ），然后依据所使用的灭菌设备，和设计出的灭菌温度和时间来计算出实际的ln ，看能否达到开始提出的无菌要求。第十八张，PPT共六十八页，创作于2022年6月ln (N

7、0/N1) = K(t1-t0)K是变数，t变化，T变化，K也变化。 升温段：T 灭菌温度tot1t2t3timeN1N2N升温保温降温N0ln(N0 / N1)ln(N2 / N)ln(N1/ N2)第十九张，PPT共六十八页，创作于2022年6月T 灭菌温度tot1t2t3timeN1N2N升温保温降温N0ln(N0 / N1)ln(N2 / N)保温段：Ln(N1/N2)= K(t2-t1) T一定，K是常数。 ln(N1 / N2)降温段：这三个判据中，保温段可以算出，升温段和降温段不好办，因为不知道T和t之间的函数关系。第二十张，PPT共六十八页，创作于2022年6月是否有这样的函数

8、关系呢？一些学者已经作出的常用的换热方式T-t关系式。第二十一张，PPT共六十八页，创作于2022年6月除了这种积分方式以外，工程上还常用图解积分法，即从设计的T-t数据换算成K-t数据，进行图解积分。第一节 分批灭菌 二 分批灭菌的设计第二十二张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第一节 分批灭菌 二 分批灭菌的设计例如：某发酵罐分批灭菌最高温度120，保持5min，设计的温度和时间关系如下：（A=7.941038min-1；E=278441J/mol;R=8.28J/molK）t0103036435055586370102120140T3050901001101201201101009

9、0604433K0000.030.363.593.590.360.03000t：min,T: , K:min-1 ,发酵罐60m3，N0=105个/ml，N=10-3问设计的T-t过程是否达到灭菌要求，如不能，应如何改进？ 第二十三张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第一节 分批灭菌 二 分批灭菌的设计解：先计算无菌程度的判据： N0/N = 61015ln (N0/N )=36.3K的数据值是由已知数据计算出的根据已有的数据作出T-t和K-t图第二十四张，PPT共六十八页，创作于2022年6月ln(N0/N3)=ln(N0/N1)+ln(N1/N2)+ln(N2/N3)= 36.3 l

10、n(N1/N2)=Kt=3.595=17.95 第二十五张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第一节 分批灭菌 二 分批灭菌的设计ln(N0/N1) +ln(N2/N3)按图解积分，求得 :ln(N0/N1) +ln(N2/N3)=15.85 ln(N0/N3)=t=34min以前和t=64min以后，K值太小，忽略不计.没有达到N3=10-3的要求 ,残留菌数N3= N0e-Kt=N0 e-33.8=1.2610-2第二十六张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第一节 分批灭菌 二 分批灭菌的设计保温阶段对杀死孢子的贡献:17.95/33.8=53%，而保温阶段时间只有5min。那么

11、如何改进设计呢？(1)增加保温时间，如果增加1min,那么ln (N1/N2) =3.596=21.54 那么ln (N0/N3) =21.54+15.85=38.39， 达到了设计要求。 (2)可以提高灭菌温度。 间歇灭菌的提温阶段和降温阶段对灭菌的贡献相对较小，而对培养基中维生素类物质的破坏作用则可能很严重。应尽量缩短提温和降温阶段。第二十七张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第二节 连续灭菌一、连续灭菌方法 第二十八张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第二十九张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第三十张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第三十一张，PPT共六十八页

12、，创作于2022年6月第三十二张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第二节 连续灭菌 一、连续灭菌方法 与间歇灭菌相比，连续灭菌的优点：1 升温和降温速度快2 灭菌温度高，保温时间短3 蒸汽用量平稳缺点：1 设备复杂，投资大。第三十三张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第二节 连续灭菌 一、连续灭菌方法空罐灭菌加热器、维持罐和冷却器也先进行灭菌。耐热性物料和不耐热性物料可分开灭菌。糖和氮源分开灭菌。第三十四张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第二节 连续灭菌二、连续灭菌反应器的流体流动模型 = 式中： 反应器中液体所占的体积（L，m3）Q：通过反应器的流体流速（L/min，m3

13、/min） 在设计连续灭菌设备时，必须认识到并不是培养基的每一质点都在反应器中停留同样的时间。 第三十五张，PPT共六十八页，创作于2022年6月活塞流（理想）滞流， V= 0.82Vmax湍流, V= 0.5 Vmax实际的反应器中，与流动方向相垂直的截面上各质点（微团）的流速不同（有流速分布）。第三十六张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第二节 连续灭菌实际的反应器中，与流动方向相垂直的截面上各质点（微团）的流速不同（有流速分布），这就必然造成物料间的（轴向）混合，这样就不能保证物料先进的先出，后进的后出，那么有的物料灭菌时间长，有的灭菌时间短，有的物料达到了灭菌要求，而有的没有达到

14、，由此我们在设计反应器时，一定考虑到这个现象，引入的概念。 第三十七张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第二节 连续灭菌返混现象 ： 反应器中停留时间不同的物料之间的混合称为返混。 按照返混的程度，在化学工程中建立了两种理想的连续流动反应器模型。连续搅拌罐（CSTR）和活塞流反应器（PFR）反应器返混为 返混为零 第三十八张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第二节 连续灭菌 在实际反应器中，其返混程度总是处于两种模型之间。搅拌良好的反应器接近于CSTR，管式反应器和填充床反应器返混程度较小，接近于PFR反应器。 这两种模型都可用于培养基灭菌以及微生物的培养。第三十九张，PPT共六十

15、八页，创作于2022年6月第二节 连续灭菌 （1）PFR模型（活塞流）plug flow reactor 物料沿同一方向以相同速度向前流动，在流动方向上没有物料返混，所有物料在反应器中的停留时间都是相同的。（长径比很大的管式反应器，没有弯头、阀门、管件、接近于PFR模型） 第四十张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第二节 连续灭菌（1）PFR模型（活塞流模型）plug flow reactor恒温热灭菌状况：1 同一截面上活孢子浓度（N）相等，热死灭速率相等。2 沿流动的方向，活孢子浓度（N）下降，热死灭速率也相应下降。第四十一张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第二节 连续灭菌（

16、1）PFR模型（活塞流模型）plug flow reactor求算N、t、L的数学关系方法：对反应器进行物料衡算。培养液通过PFR全反应器所达到的灭菌程度的计算：先对微元物料衡算，再沿流动方向的长度积分。第四十二张，PPT共六十八页，创作于2022年6月物料衡算通式：进入量=排出量+反应量+积累量dv足够小，可以认为在此微元内N相等，热死灭速率处处相等，是均一体系。QN=Q（N+dN）+ KNAdl + 0 A为横截面积整理得：QdN=-KNAdl第四十三张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第二节 连续灭菌（1）PFR模型（活塞流模型）plug flow reactorQdN=-KNAd

17、l ，积分 结论：活塞流的灭菌效果与间歇反应器的分 批灭菌效果相同。 第四十四张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第四十五张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第二节 连续灭菌（2）CSTR模型（全混流模型）Continued flow Stirred Tank Reactor第四十六张，PPT共六十八页，创作于2022年6月连续搅拌罐反应器的结构基本上与间歇操作的搅拌罐反应器相同。两者的根本差别在于：1 连续操作。2 反应器内料液组成（等于出料液组成），不随时间而变化。搅拌强烈的实际连续反应器（机械搅拌、气流或液流搅拌）可以接近于CSTR特性。 第四十七张，PPT共六十八页，创作于

18、2022年6月第二节 连续灭菌（2）CSTR模型（全混流模型）求算N、t 、V的数学关系方法：对整个反应器进行物料衡算。物料衡算通式：进入量=排出量+反应量+积累量 QN0 = QN + KNV + 0整理QN0=N（Q+KV） 第四十八张，PPT共六十八页，创作于2022年6月QN0=N（Q+KV）第二节 连续灭菌（2）CSTR模型（全混流模型）第四十九张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第二节 连续灭菌CSTR和PFR灭菌效果的比较PFR:e-kt =要达到相同的灭菌效果， 即需要的灭菌时间长？一定，那么哪一种反应器结论：CSTR需要的时间长。CSTR：第五十张，PPT共六十八页，创

19、作于2022年6月第二节 连续灭菌（3）多级全混流釜模型Multiple CSTRs in series 在工程实践中常将几个CSTR反应器串联使用，来接近PFR的效果。 tN0 活塞流多釜串联 多级全混流釜串联模型及其浓度分布图第五十一张，PPT共六十八页，创作于2022年6月Multiple CSTRs in series 为每个串联反应器的平均停留时间。如果让多级全混流釜模型有PFR效果，则：=t=n ， （1+K）n=e kn 当= 0 ，n=时，有活塞流的效果。第五十二张，PPT共六十八页，创作于2022年6月第二节 连续灭菌（4）扩散模型返混：是不同反应时间的物料之间的混合。PFR

20、：返混程度最小CSTR：返混程度最大高/径，返混程度高/径，返混程度 实际操作的大部分反应器都介于这两种理想的反应器之间。第五十三张，PPT共六十八页，创作于2022年6月 返混是个复杂的现象，到目前为止还不能用数学解析的方法表示出来，在实际的工程中，又要涉及到这个问题，怎么办？ 把这个复杂的现象用数学模型表示，使简单的模型和复杂的系统具有等效性。 扩散模型第五十四张，PPT共六十八页，创作于2022年6月活塞流 扩散流动 流体在管内流动，由于分子扩散和涡流扩散的作用使一部分流体质点返混了回去，这个过程简化为在活塞流动中叠加了一个与流动方向相反的扩散。第五十五张，PPT共六十八页，创作于202

21、2年6月费克定律：扩散通量（沿轴方向）=DeDe：轴向扩散系数cm2/sC：质点浓度 个/cm3 L：扩散距离 cm扩散通量的物理意义： 单位时间内，单位面积通过的质点个数， 单位：个/s cm2 。第五十六张，PPT共六十八页，创作于2022年6月 把这两种流动叠加，对进出任一微元体积的活孢子数进行衡算。 AUc+A De （c+dc）=AU(c+dc)+A De +KcAdl+0 进入的 离开的 死掉的 积累的 整理为： De - u -Kc = 0 第五十七张，PPT共六十八页，创作于2022年6月整理为：常系数齐次线性二阶微分方程式中c：活孢子浓度（个/cm3） De：轴向扩散系数 （

22、cm2/s） L：轴向长度 cm把参数变成无因次式：设定一个准数 ： =时是活塞流（De=0，无返混） =0时是全混流（De=全是混返，最大） 第五十八张，PPT共六十八页，创作于2022年6月把上面的关系代入微分方程，整理得：这是常系数二阶齐次线性微分方程 特征方程：r2-Nper-NpeK=0r1，2= ， r1r2 是两个不相等的实根微分方程的通解为 ：第五十九张，PPT共六十八页，创作于2022年6月需确定c1，c2边界条件：l = 0，即 =0时， =1L=L，即 =1时， = 0 ，因此时N很小，反应速率趋于零。C1+C2=1联立解方程：第六十张，PPT共六十八页，创作于2022年6月解得： 其中= ，Npe= 可见 不但是K的函数，而且与返混程度有关，也是Npe的函数。这样的公式应用起来太麻烦，有学者作了算图，将灭菌程度 对应于K作图，以Npe= 为参数。 第六十一张，PPT共六十八页，创作于2022年6月由 和Npe查得 K ，求算出。下面看Npe的确定：需确定De 第六十二张，PPT共六十八页，创作于2022年6月levenspiel实验（1958），确定了Re与之间的关系。实际中遇到