中性pH条件下化能异养硝酸盐还原菌对亚铁离子的好氧与厌

1、中性 pH 条件下化能异养硝酸盐还原菌对亚铁离子的好氧与厌氧氧化Arch Microbiol1998, 169:159-165IF= 1.975摘要：百分之九十的厌氧富集培养都出自于一些淡水沉积物试样以及一些海洋沉积物，在pH 7.2 、 30条件下下，沉积物中的亚铁离子在硝酸盐和有机辅助物的矿物媒介中被氧化。厌氧硝化的亚铁氧化是一个生物过程。从苦咸水沉积物中分离出的一种微生物（HidR2 ，运动型不产芽孢的革兰氏阴性棒状菌），进一步研究在醋酸盐环境中对亚铁离子的氧化作用。在微量醋酸盐 （0.21.1 mM ）环境中，pH 7.2 、30条件下，HidR2 菌能厌氧和好氧氧化0.74.9mM

2、的亚铁离子， 其用于生长的能量来自于亚铁离子的厌氧硝化氧化，铁氧化比率是一个常数，取决于醋酸盐的量的给予。中性条件下硝酸盐厌氧氧化亚铁离子的能力似乎是嗜温反硝化细菌的共有特性。由于依赖硝酸盐的铁离子氧化关闭沉积物缺氧区的铁循环、铁离子的好氧氧化促进含氧区内的二价铁再氧化为三价铁，这两个过程都增加了铁离子在自然沉积物的有机质循环转化中作为过渡电子载体的重要性。关键词： 铁氧化亚铁离子高铁离子硝酸还原作用沉积物引言铁元素是地壳中含量最丰富的元素之一，也是含量第二丰富的金属元素。由于其低水溶性，铁氧化物在水环境中通常以沉淀形式存在，如复杂的非晶形或晶体结构(Cornell andSchwertman

3、n 1996) 。三价铁离子能够被异养菌还原为二价铁离子(Lovley 1991)，在有氧条件下，亚铁离子可以在低 pH 值中被嗜酸细菌如氧化亚铁硫杆菌再次氧化(Blakeet al. 1993) ，或者在近中性环境里，被铁锈色披毛菌氧化 (Hallbeck et al. 1993) ，这两种细菌都是从氧化还原反应中获取能量而生长。Fe3+/Fe2+的标准氧化还原电位为 +770 mV ，但是在自然环境中其实际的氧化还原电位很大程度上取决于 pH 值的变化 (Widdelet al. 1993) 。在 pH 7的碳酸氢盐环境下，FeOOH/FeCO 3的氧化还原过渡电位 E值约为 +200 m

4、V 。在较低的氧化还原电位下， 亚铁离子也能够充当给电子体， 从而在厌氧环境中发生还原反应，最近有研究者可以分离和描述能利用亚铁离子作为电子供体的不产氧光合细菌(Widdel et al. 1993; Ehrenreich and Widdel 1994) 硝酸盐异化作用，最近报道了一种嗜温细菌。+200 mV 下的释放电子也可以用作微生物的 (Straub et al. 1996) 和一种极端嗜热的古细菌(Hafenbradl et al. 1996) 都具有这种新陈代谢功能。这一过程将铁循环和氮循环联系上，因此也显示了微生物厌氧环境中铁离子作为电子受体的重要性。 本文主要研究在兼性厌氧硝酸

5、还原菌辅助作用下亚铁离子的氧化过程。材料和方法2.1 微生物的来源由于采取加富培养，各种沉积物试样被作为接种源，有淡水源（ Vorsee,Mittlerer Buchensee,and Lake Constance,Germany）、海水源（ Venice, Italy; Ameland and Groningen,Netherlands ） 、盐水源（ Hiddensee,Germany）以及市政污水处理中使用的活性污泥源（ Ko nstanz,Germany）。2.2 培养介质和培养方法对于淡水和海水中细菌的加富培养，使用在缺氧条件下的碳酸氢盐缓冲溶液作矿质媒介，且加入 1mM 的硫酸盐作

6、为硫源，不需加还原剂，NaCl 和 MgCl 2的浓度则与微生物本身的环境相适应，淡水中NaCl 和 MgCl2 6H2O 的量分别为 1.0 g 和 0.4 g，盐水中为 7.0 g 和1.0 g海水中则为 20.0 g和 3.0g。经高压灭菌， N 2/CO2 (80:20, v/v) 冷却后，每升溶液中分别加入 1ml微量元素溶液 SL9(Tschech and Pfennig 1984)和 7-维生素溶液 (Widdel and Pfennig 1981)，并将 pH 调至 7.2,。而对于需氧培养实验，培养基仍和上述方法一样，所不同的是缓冲溶液由羟乙基哌嗪乙硫磺酸所替代。2.3 富集

7、与分离将 50ml 高压灭菌后的培养基装入120ml 规格的血清瓶中，用丁基橡皮塞密封好，在缺氧条件下往里加入约 5ml的接种体。并无菌地向基底分别注入浓度为4mM 硫酸亚铁和 5mM硝酸盐。每个接种体均在pH为 6.5、 7.0、 8.0，温度为 16和30下富集培养。培养周期为24周，以棕色锈状沉淀形成为一个周期。苦咸水培养的细菌的纯化是用的琼脂稀释法(Pfennigand Tr per 1981)： 60下向 25ml的试管中加入 3ml 3% （w/v ）的琼脂溶液，再加入8 mM硫酸亚铁溶液，小心混匀，然后，加入 7ml 42 预热的含5 mM 硝酸盐培养基，得到的亚铁离子最终浓度为

8、4 mM 。每根稀释后的试管都经过密封、 接种、 水域冷凝以及 N2/CO2(80:20, v/v) 气体吹扫， 最后置于避光的 30恒温箱中培养。在进入液体培养基前，微生物都是在琼脂上生长繁殖的。淡水和海水微生物的纯培养在平板基上分离。平板基的基质也是上述培养基加入0.01M丙磺酸作为缓冲溶液、1.5% （ w/v ）的琼脂、5mM 硝酸盐和 3 mM 醋酸盐。在 30，N2/CO 2(80:20, v/v) 气氛下进行避光平板接种。培养好的菌种转移到呈有淡水培养基的血清瓶60ml ）中。只有在瓶子中进行亚铁离子氧化的微生物才在琼脂板上显示多于两条条纹从而得以纯化，并且将其转移到液体培养基中

9、培养。在含有矿物质元素和 0.2%的酵母膏的培养基中培养后的微生物在显微镜下进行纯化检查。培养期间需定期用显微镜检查微生物是否被污染。 检测鞭毛是否形成， 使用的方法是布雷登 -戈登堡银侵染法。2.4 增长实验细菌在装有 300ml 培养基的瓶（500ml ）中培养，未接种的空白试验瓶在相同条件下培养至少两个月， 但是始终未见到有能氧化二价铁离子的微生物产生。经过震荡后的样品放入具塞瓶中， 用N 2/CO2 (80:20, v/v) 气预吹，然后转移到盐酸或者磷酸缓冲溶液中准备下一步分析。为保证在氧气梯度管中的生长实验，将 4ml 缺氧培养基装入 22ml试管中，培养基中含有1.5% (w/v

10、) 琼脂糖、 15 mM 亚铁离子、 1 mM 醋酸盐。在氮气保护下，等第一层凝结后，再加入第二层培养基 （ 0.5% (w/v) 琼脂糖），将微生物接种在这一层上。 等到第二层氮气保护下凝固好以后再往上面加入1ml 原培养基不含琼脂糖，为的是防止第二层琼脂糖的干结。试管用铝盖轻轻盖上，垂直放入暗箱中在30下，振荡培养（80rpm）。以上所有试验重复一遍2.5 分析方法亚铁离子的量用亚铁嗪分光光度法来测定(Stookey 1970) 。总铁离子的浓度测定也是用同样的方法即加入盐酸羟胺将所有的铁离子都还原成亚铁离子态(Stookey1970) 。三价铁离子则有上述二者差值得到。为得到亚硝酸盐的含

11、量，样品与一体积500mM 的磷酸缓冲溶液在厌氧环境下混合， 并在室温下反应15分钟，然后在离心机上用最大转速离心5分钟。 用1ml1M 的盐酸将其又恢复粒子态。这样处理可以避免亚硝酸盐在分析前和分析过程中被亚铁离子所氧化。如果试样中含有超过1mM 的亚硝酸盐，则这个过程必须重复至少两次。由于铁离子分析是在梯度管中进行的，所以琼脂糖要用刀片切成2mm后的薄片并加入 1ml 5M 的盐酸。在 40水浴中静置 15分钟后，薄片已被酸化成液体，铁离子在上述过程中被测量完毕。硝酸盐和亚硝酸盐用带有格鲁姆阴离子交换柱(Grom, Herrenberg, Germany)的高效液相色谱来进行定量分析，在2

12、20nm下进行吸收检测。为了抑制铁离子和亚硝酸盐的相互反应，并且为保护色谱柱， 含铁样品中得加入磷酸缓冲溶液，上清液用于硝酸盐亚硝酸盐的检测。这种方法的对亚硝酸盐的检出限大约是30 M。醋酸盐用气相色谱（GC6000 Vega Series 2; Carlo Erba, Milan, Italy）分析，使用填充柱（2 m2mm; 60/80 Carbopack C/0.3% carbowax 20 M/0.1% H3PO4），火焰离子检测器。为了保护柱子， 醋酸盐试样也按上述方法准备。氧化二氮也用上述气相色谱分析，使用的填充柱2 m2 mm; 60/80 Carbosieve SII (Sup

13、elco, Bellefonte, Pa., USA)和检测器（热导池检测器）不一样。根据 Hall和 Aller(1992) ，铵盐用流动注射分析。蛋白质由以下分析：测定含铁样品中蛋白质的含量，需要准备含有试样中相同铁量的蛋白质标样，为的是测定蛋白质化学分析中与铁离子的可能反应。由于几种HidR2 菌所对应的不同的光密度的蛋白质含量与干重呈一种相关关系，根据这种关系，可以来计算蛋白质的干重。梯度管中的氧含量用三维显微操作器驱动氧微电极而测定。3 结果3.1 富集培养在 710天的培养下， 除了威尼斯海峡采集的沉积物以外， 所有的富集培养都形成了棕色锈状沉淀。 通过化学分析， 这些沉淀都被确定

14、为铁的氢氧化物， 而在未富集培养的培养基里都未发现亚铁的氧化作用。 经过三到四次转移培养， 需加入醋酸盐或者琥珀酸盐作为有机补给物以维持亚铁离子的氧化作用环境。 只有从格罗宁根市海洋沉淀物中富集培养的培养基不用加入补给物而能不断氧化亚铁离子， 即使重复转移一年以上也能进行反应。 在比较所有富集培养后发现， 无论是在 16或 30还是 pH为 6.5或8，亚铁离子的转化率和潜伏程度都没有明显的改变。3.2 纯培养的特征从所有能发生亚铁离子氧化反应的富集培养中来看，纯培养独立的显示了亚铁离子厌氧氧化过程中醋酸盐是作为有机补给物而硝酸盐则是作为电子受体。 从波罗的海沉积物中分离出来的 HidR2 菌

15、种将被作为进一步研究的对象。图1HidR2 菌在醋酸盐和硝酸盐厌氧生长中的相差显微镜照片（图中横杠表示10微米）HidR2 菌属于革兰氏阴性，不产孢子的杆菌，大小为36 1m（图 1），单极鞭毛运动型，对氧化酶和过氧化氢酶产生极性。通过相差显微镜观察到细胞两端有微小深色包涵体，用三氯甲烷处理后， 这些包涵体消失， 可能是由于聚羟基脂肪酸的富集产生。 在过量醋酸盐（ 3 mM ）中培养后， HidR2 菌每一批能产生约 1050个细胞。在含有亚铁离子、醋酸盐和硝酸盐的液体培养基中，通过 4,6-二脒基 -2- 苯吲哚盐酸染色法，可以发现绝大多数细胞都含有絮状的三氧化铁或者肉眼可见的姜铁矿，但氢氧

16、化铁并非包裹在细胞外部。在含醋酸盐和硝酸盐的琼脂培养基中，HidR2 菌形成的则是白色松软的菌落。在在含亚铁离子、醋酸盐和硝酸盐的琼脂培养基里，形成的是深褐色的边缘不规则的球形菌落。此菌的温度适宜范围是540，最适温度是33， pH 范围在 5.59.5 之间，最适pH 是 7.5。在含硝酸盐、亚硝酸盐或者氧化二氮的厌氧环境中或者在好氧环境中与氧反应的时候，HidR2 菌始终是作为电子受体。且在含有硫酸盐、 延胡索酸盐或无定形氢氧化铁（作为电子受体） Lovley and Phillips 1986以及醋酸或琥珀酸盐（作为给电子体）的培养基中，HidR2 菌不能生长。经测试和氧化后的给电子体有

17、葡萄糖、果糖、木糖、树胶醛糖、丙酸盐、丁酸盐、L- 乳酸盐、异丁酸盐、琥珀酸盐、乙二醇、乙醇、甘氨酸和酵母膏；异戊酸、苯酸盐、甲醇和氨则不能被氧化。3.3 HidR2菌对亚铁离子的厌氧氧化作用在没有有机补给物的厌氧环境中，HidR2 菌不能生长也不能对亚铁离子的氧化进行有效的测量，而加入醋酸或者琥珀酸以后效果就发生了明显的变化。图 2 a， b在pH 6.7 、30，含有硝酸盐和醋酸盐的培养基中，HidR2 菌对亚铁离子的厌氧硝化氧化作用，亚硝酸盐未检测到（检出限为30M ）。 a.不含亚铁离子；b.含有亚铁离子。：蛋白质：硝酸盐：醋酸盐：亚铁离子：铁离子在 pH 6.7 、30条件下， 醋酸

18、盐作为补给物，图2记录了 HidR2 菌对亚铁离子的厌氧硝化氧化作用， 并且与不含亚铁离子的做了对比。在含有亚铁离子的培养基里，细胞以指数方式生长，这种速度能持续 45个小时。随着醋酸盐的消耗， 大约 14天左右细胞仍以两倍速度增长，这取决于初始醋酸盐的浓度值。 在没有亚铁离子的培养基里， 细胞以指数形式增长只能维持11个小时。从表 1可以看出， HidR2 菌在醋酸盐和亚铁离子作为底物的情况下，将硝酸盐转化为了氮气和氧化二氮，这一点和其他种类的微生物作用一样。这一过程中并没有形成氨，因为氨不能在厌氧环境中氧化。 在高压灭菌处理后， 同样的试验方法没有得到亚铁离子氧化和蛋白质量增加的结果。表

19、1总结了厌氧条件下含和不含亚铁离子的情况，指出亚铁离子的氧化并不完全，添加的亚铁离子只有近 90%被氧化。通过加入 1mM 的醋酸盐或者 5mM 的亚硫酸铁，也不能改变这一比例，这表明细胞无法利用剩余的亚铁离子。为证明醋酸盐对亚铁离子氧化程度的影响，设计了一系列不同醋酸盐浓度的生长实验（图 3）。约每增加 1mM 醋酸盐能够稳定地影响铁离子氧化的量，每消耗 1mol 的醋酸盐就会反应 4mol的亚铁离子。当超过供给铁离子的 90%以后，即使再增加醋酸盐的量，铁离子也不会再被氧化。3.4 HidR2 菌对亚铁离子的好氧氧化作用图 4给出了在含有梯度氧浓度和亚铁离子以及少量醋酸盐的半固体培养基中，

20、通过 HidR2 菌新陈代谢对铁和氧的形成的影响。将未接种的试管中也进行了同样的试验，为的是观察生物和化学氧化铁离子的不同。微生物在空气环境中培养4周，在培养后，在琼脂糖下面形成了一片一片表面光滑且多层薄而紧密的多层含铁层。而在对照管内并没有形成上述一样的层面， 而是形成的橘色的铁离子层，比上述管内的层面要浅，但是更宽。 化学分析表明：相对于未接种 HidR2 菌的化学氧化而言，三价铁沉淀物的最大条带在琼脂培养基中位置要深很多，其氧分压也要低很多，因此可以证实肉眼观察到的现象：二价铁可被 HidR2 菌有氧氧化。显然， HidR2 菌细胞能将大部分三价铁固定到明显的一层，这一点在自然沉积物中也

21、有发现。表 1 HidR2 菌在含有醋酸盐和硝酸盐的培养基中，加铁和不加铁的厌氧生长情况下，其生长化学当量比和底物转化情况。每一列代表着添加各种浓度的醋酸盐和亚硫酸铁的独立实验。低浓度醋酸盐对应着低的细胞产率（第一、二列）不能给出可靠的蛋白质形成试验；相反地，在高浓度醋酸情况下的实验（第三、四列）下，表中也没有关于干重的计算。所以用于细胞合成的电子也没有考虑在平衡计算中（第一、二列）nd表示未检测到） 。a醋酸盐的量是以 C4H7O3形式的干重计算，根据方程：+-17acetate+11H 8C4H7O3+2HCO3+4OH醋酸盐氧化的量是根据醋酸消耗量减去醋酸累计量电子的回收率是用消耗硝酸盐

22、氧化为氮气和部分氧化二氮减少的电子除以从醋酸盐氧化得到的电子（第四列）或者是从加了铁盐的醋酸盐氧化中的电子（ 13列）得到的。 由于第一、 二列没有计算出醋酸的氧化，所以可以得出醋酸是100%的消耗掉。图 3 培养基中含有 8mM 亚硫酸铁和 5mM 硝酸盐以及各种浓度的醋酸盐条件下，HidR2 菌对亚铁的氧化和醋酸的消耗情况。在pH=6.8 ，30下避光培养 3周。3.5 化学方法亚铁氧化作为对照试验化学方法氧化亚铁离子的条件和HidR2 细菌的生长条件采用的是一样的，由于分子氧能很容易地氧化亚铁， 例如不包含培养液的条件就可以检查分子氧通过穿透橡胶塞导致铁产生化学性氧化。这种方法显示了在上

23、述条件下培养6周也不会检测到亚铁离子的氧化。向 pH 为 6.7含 8mM 亚铁离子的厌氧培养基中加入5mM 的亚硝酸盐可以加快亚铁离子的氧化速度。 在4天内，亚铁离子的氧化速度为8m/h，而要消耗约 0.8mM 的亚硝酸盐。 而当加入1mM 和 0.3mM 的亚硝酸盐时，在相同条件下均未检测到亚铁离子的氧化作用。图 4 a，b 在30摇床上培养 30天后，琼脂氧 - 二价铁梯度管中三价铁和氧的变化。a是 HidR2 菌的培养情况；b是对照实验。条状代表三价铁，圆点代表氧。4 讨论在本文中， 已经很详细的介绍了脱氮细菌在pH 7.2 和 30下加入少量有机补给物而观察在厌氧和好氧条件下对亚铁的

24、氧化作用。鉴于在pH 7.2 下亚铁离子有很强的亲氧能力，控制氧条件是很有必要的，主要是要区分生物氧化和非生物氧化亚铁离子。一定要注意避免氧从塞子进入培养基中，并且亚硝酸盐也要在培养过程中随时检测，因为在硝酸盐反应过程中亚硝酸盐可能富集，而它可以促进亚铁离子的化学氧化(Komatsu et al.1977; Moraghan and Buresh 1977; Christianson and Cho 1983; Brons et al. 1991)。由于HidR2菌在有机辅助物存在下能形成大量的三价铁离子， 所以我们要排除由于硝酸盐还原产生的亚硝酸盐和氧化二氮的化学氧化的干扰，对照试验可以得出

25、以下结论：氧气穿透橡胶塞进入培养基中氧化亚铁这个假设不成立，因为在没有微生物中的对照瓶中经过 6周都没有检测到铁离子氧化作用。2. 在HidR2 菌的培养基中，亚硝酸盐的促进作用也不成立，因为高于 30 M （检出限）的浓度下也没有被检测到； 如果亚硝酸盐浓度在几个毫摩下才会对亚铁离子的化学氧化产生影响，众所周知，这种情况只会发生在一些分批培养的脱氮剂中。3. 氧化二氮的对亚铁氧化的影响同样可以被排除，et al. 1996)，相当于 2mmol/l ，不会对铁产生氧化。因为浓度为50ml/l 的氧化二氮(Straub由于所有化学氧化实验我们都按照生物实验条件来开展的，可以证明厌氧硝酸盐化的亚

26、铁离子氧化作用是一个生物催化反应。我们证明了 HidR2 菌能够利用从亚铁离子氧化过程中得到的电子用于其异氧新陈代谢，从而获取能量。这一结论是基于HidR2 菌的产率比较，在含有亚铁离子的培养基的产率要比只含醋酸盐的产率高55%（表 1）。HidR2 菌的质量仍然是随着醋酸盐的减少而增加（图2）的也能支持这一结论。很明显，醋酸盐在HidR2 菌的细胞合成过程是必不可少的，此微生物不是自养型的。 然而，醋酸盐并不是完全同化于细胞中，部分醋酸盐也反应在了多余的亚铁盐中。当以足量醋酸盐给予反应时，其氧化反应和铁的是同时进行的，且以1:4的速率进行着（图 3）。显而易见的是， 醋酸盐氧化所提供的电子用

27、于醋酸吸收，这些电子不能在氧化铁时被细胞所还原， 可能是由于缺乏适合的反电子传递系统。含每摩尔醋酸的细胞产量 （干重 14g）和每摩尔醋酸加了4 摩尔亚铁的细胞产量（19g ）比较可以看出，在细胞新陈代谢机制（1.75g/mol e-）中，醋酸电子（ E0mV ）要比亚铁氧化（ 1.0g/mole-， EmV）产生的电子效用高两倍以上。这一结论可以很好的解释所有的能量都由硝酸盐的电子转移而产0mV 所有计算都是基于 Thauer et al. (1977) 。生2 NO 3 /N 2的E当在含有亚铁离子的厌氧环境中，发现HidR2 菌生长缓慢，但这一现象并不一定是与铁氧化代谢有关， 可能是由于

28、过量亚铁中毒的现象，或者是由于磷酸盐或其他微生物营养物的低利用效率，也可能是这些营养物质与铁发生了沉淀反应(Hughes and Poole 1991)。关于铁厌氧氧化的生化作用仍然有几个公开的问题。要观察能量节省需要一个质子能够穿过细胞膜而转移出来，我们并不知道亚铁离子是在细胞的那个部位氧化的，在亚硝酸盐和氧化二氮存在的条件下，如果亚铁氧化定位在胞外质的话，问题就是形成的氢氧化铁是如何转移到培养基中的。 例如， 亚铁离子还能够在细胞外面发生氧化反应。这就需要一个电子转移系统穿过胞外质（如细胞色素）Stouthamer 1991; Ferguson 1994。像这种电子载体已经被认为是嗜酸厌氧铁氧化的氧化剂(Blakeet al. 1993)。因为 HidR2