鼠HMGB1蛋白的原核表达及分离纯化

1、鼠HMGB1卵白的原核表达及分散纯化赵中夫杨慧刘明社张芸杨柳絮封江南【关键词】高迁徙率族卵白1；原核表达载体；纯化摘要目的：克隆小鼠HGB1基因，构建原核表达载体，在大肠杆菌中诱导表达并分散纯化得到His-HGB1的交融卵白。要领：脂多糖刺激后的RA264.7细胞，提取总RNA，经RT-PR扩增出含HGB1的目的片断，克隆于pD-19T载体，再亚克隆至含有pelB引导肽及His-标签肽的高效表达载体pET-26b(+)，转化大肠杆菌BL21DE3，经IPTG诱导后行SDS断定目的卵白表达，用镍鳌合琼脂糖凝胶亲和层析法分散纯化含His-标签肽的目的卵白。效果：经PR扩增出巨细为648bp的HGB

2、1基因片断，乐成构建目的卵白的交融表达载体，经诱导表达及分散纯化，得到了约30kD的交融卵白。结论：构建HGB1的交融表达载体，得到分散纯化交融卵白His-HGB1，为进一步研究其生物学成效奠基了基矗关键词高迁徙率族卵白1；原核表达载体；纯化useHGB1PrkarytiExpressinandPurifiatinKeyrdsHighbilitygrupbx1;Prkarytiexpressinvetr;Purifiatin高迁徙率族卵白B1(Highbilitygrupbx1，HGB1)是普及存在于真核细胞内的高度守旧的非组卵白染色体卵白，根本组全长648bp编码215个氨基酸残基。已有研究

3、表白，HGB1可由巨噬细胞或单核细胞等自动排泄，或由坏死细胞被动开释，从而作为一种炎症晚期因子到场脓毒症等病理历程，。研究还创造经脂多糖LPS刺激巨噬细胞后HGB1的排泄量较未刺激显着增多，而且在8h12h达峰值。而HGB1发挥作用的机制还不是很明晰。因此，分散纯化HGB1卵白将对进一步研究HGB1的生物学成效、与其他细胞因子的彼此作用干系等有紧张意义。本实行以小鼠巨噬细胞RA264.7为研究工具，经LPS刺激后12h提取细胞总RNA，接纳RT-PR扩增出含HGB1的目的序列，构建pD-19T-HGB1重组载体,亚克隆至高效表达载体pET-26b(+)，诱导表达并分散纯化含His-标签肽的HG

4、B1交融卵白。1质料和要领1.2要领2效果2.2重组原核表达载体的构建与断定将HGB1的PR产物克隆于载体pD-19T，以BaH和Xh酶切pD-19T-HGB1，接纳目的片断，并将其亚克隆至经同样酶切的含pel引导肽及His-标签肽的原核表达载体pET-26b(+)，经酶切断定及序列阐发证明已乐成构建交融表达载体pET-26b(+)-HGB1。见图2。2.3重组卵白表达与纯化重组原核表达载体pET-26b(+)-HGB1转化大肠杆菌BL21DE3，37IPTG诱导4h，裂解细胞，将裂解液离心后分出上清与沉淀，经SDS阐创造白诱导产物重要以可溶性情势存在于上清液后。将含可溶性重组卵白的上清液用N

5、i-NTA柱分散纯化，网络穿透液及各浓度的咪唑洗脱液，可见随着咪唑缓冲液浓度增长及洗脱次数增长，洗脱液中杂卵白渐渐淘汰，至300咪唑洗脱液中得到较高纯度的目的卵白HGB1。见图3。3讨论高迁徙率族卵白B1(Highbilitygrupbx1HGB1)固然普及存在于真核细胞内，但是差异的构造细胞，乃至雷同构造细胞在差异生理状态下的表达环境并不同等。体外实行不雅察到，LPS可引起人类外周血单核细胞及LPS敏感型小鼠巨噬细胞HGB1的表达和开释5、6。为得到大量HGB1模板，我们用100ng/LLPS刺激体外造就的小鼠腹腔巨噬细胞系RA264.7，12h后劳绩细胞抽提总RNA，RT-PR效果表现得到

6、了富足量的目的片断。RA264.7细胞是被普及用于体外巨噬细胞系，担当LPS刺激后RA264.7细胞能表达和开释包罗HGB1在内的多种细胞因子。以它为研究工具的HGB1基因克垄原核表达和纯化的实行有轻便和易于操纵等长处。为了使目的卵白在原核细胞中排泄型表达，淘汰原核表达的卵白产物在细胞浆中过分聚拢形成包容体而导致生物学活性落落的大概，本实行选用pET-26b(+)质粒作为目的卵白重组载体，这一载体在多克隆位点卑劣含有pelB信号肽，可以引导表达的卵白进入细胞周间质，信号肽即被卵白酶水解，而产生越发不变的游离表达产物。由于表达的卵白可以在细胞周间质举行折叠，大概具有自然卵白的构象，以是生物学活性

7、较好。别的，pET-26b(+)质粒载体中含有由六个组氨酸构成的His-标签，与目的卵白交融表达后便于通过Ni2+亲和层析柱举行分散纯化，而6His标签一样平常不影响卵白质的排泄或折叠，因此不会滋扰卵白的布局与成效，无须在纯化之后将其从卵白上去除，。本研究乐成构建了HGB1原核表达载体，而且得到纯化的含His-标签肽的交融卵白，为以后进一步研究其生物学成效奠基基矗参考文献ullerS,RnfaniL,BianhiE.RegulatedexpressinandsubellularlalizatinfHGB1,ahratinprteinithaytkinefuntin.JurnalfInterna

8、lediine,2022,255：332343.GardellaS,Andrei,FerreraD,etal.ThenulearprteinHGB1isseretedbynytesviaann-lassial,vesile-ediatedseretrypathay.EBRep,2002,3：9951001.DbeliH,TreziakA,GillessenD,etal.Expressin,purifiatin,biheialharaterizatinandinhibitinfrebinantplasdiufaliparualdlase.lBiheParasitl,1990,41：259268LindnerP,GutllB,ulfing,etal.Purifiatinfnativeprte