2021年脑缺血k选修精品资料PPT

1、2021年脑缺血k选修精品资料PPT2021年脑缺血k选修精品资料PPT第一节 概述脑缺血是一种常见病，已成为引起人类死亡的第三大原因。引起脑缺血的原因很多。脑缺血可导致许多病理生理改变。2第一节 概述脑缺血是一种常见病，已成为引起人类死亡的第三大短暂性的局灶性脑缺血，往往引起缺血中心部位的梗死。梗死区（core）的细胞表现为水肿和坏死。梗死的边缘区又称为半影区（penumbra）。随着缺血程度的加重或缺血时间的延长，半影区的神经元损伤也随之加重，甚至导致继发性死亡，使原有的梗死区进一步扩大。 通常讲的脑保护效应，主要是指对梗死的边缘区神经元的保护。 概述3短暂性的局灶性脑缺血，往往引起缺血中

2、心部位的梗死。概述5脑缺血损害病灶图示a脑缺血阈值和脑缺血损害程度b缺血半带和中心区4脑缺血损害病灶图示a脑缺血阈值和脑缺血损害程度b缺血半带一、缺血的脑组织病理学 组织学的改变应当发生在生化改变之后，但在脑缺血数分钟之后即可见到某些形态学改变。 神经细胞的改变早于星形细胞和内皮细胞。 线粒体水肿及嵴结构紊乱，胞浆中出现小空泡，此即早期的神经元小空泡形成阶段 ，水肿使离子梯度丧失。此时立刻恢复再灌流仍是可逆的。 随着缺血加重，细胞皱缩、核移位、细胞染色加深。最后染色质积聚、微管断裂、核蛋白弥散、细胞周围出现电子致密层。 5一、缺血的脑组织病理学 组织学的改变应当发生在生化改变之后，缺血后细胞水

3、肿6缺血后细胞水肿8神经元选择性易受累。 一些选择性容易受损的细胞群，在全脑缺血后进行再灌流，有些部位如海马CA1、CA3、CA4区的锥体细胞和纹状体的中、小细胞所受损害较别的地方严重，小脑Purkinje细胞和大脑皮层的第3、5、6层神经细胞也较容易受损，胶质细胞则保持良好；同时这些神经元中有一些容易出现迟发的自溶趋向，它们在灌流后当时功能和形态均完好，而数小时至数日后出现自溶。7神经元选择性易受累。 9大鼠全脑缺血损伤海马区Nissl染色法 A, B缺血组; C, D正常对照组8大鼠全脑缺血损伤海马区Nissl染色法 A, B缺血组; 大鼠海马CA1区缺血/再灌注GFAP及nestin染色

4、图片 9大鼠海马CA1区缺血/再灌注GFAP及nestin染色图片 二、脑梗死的临床表现 脑梗死（cerebral infarction）是指由于脑部血液供应障碍，缺血、缺氧引起脑组织坏死。临床上常见的有动脉血栓性脑梗死、脑栓塞 。动脉血栓性脑梗死多见于50-60岁以上患有动脉硬化的老年人。有报告在65-74岁年龄组发病率达每年1，男性稍多于女性，常伴有高血压、冠心病、糖尿病。多于静态突然发病，常在数分钟到数小时，甚至1-2天达高峰。通常意识清楚，生命体征平稳，但当大脑半球较大区域梗死或基底动脉闭塞病情严重时，意识可不清，甚至出现脑病，引起死亡。 10二、脑梗死的临床表现 脑梗死（cerebr

5、al infarc11131临床类型 （1）完全性 （2）进展性 （3）可逆性脑缺血发作或称可逆性缺血性神经功能缺损 121临床类型 142.不同动脉闭塞时的临床表现由于血栓形成的部位不同，出现相应动脉支配区的神经功能障碍。 大脑中动脉是颈内动脉的直接延续，供应大脑半球血流量的80左右，供应大脑半球背外侧面的2/3和尾状核、豆状核。是血栓形成与脑栓塞的好发部位。 大脑中动脉主干闭塞：表现为对侧偏瘫、偏身感觉障碍和偏盲。 132.不同动脉闭塞时的临床表现由于血栓形成的部位不同，出现相应1416三、研究常用实验模型 （一）全脑缺血实验模型1.蒙古沙土鼠全脑缺血模型 ：由于该动物大脑基底动脉环的畸形

6、，当双侧颈动脉结扎阻断脑血供后椎动脉不能代偿，而造成全脑缺血。 2.四动脉结扎全脑缺血模型：大鼠四动脉结扎，造成全脑血供障碍。 这两种模型均用于模拟临床上心脏骤停而造成全脑的短暂性缺血。 15三、研究常用实验模型 （一）全脑缺血实验模型17（二）局部脑缺血的模型 1.线栓法 ：通过颈内动脉插入颅内动脉，阻塞大脑中动脉的分叉入口处血流，造成大脑中动脉血供支配脑区的缺血。可将尼龙线取出，造成缺血脑区血流的再灌注。此模型主要用于局部脑缺血再灌注神经元损伤的病理机制。 2.光化学脑栓塞局灶性脑缺血模型 ：动物静脉内注入光敏剂，用立体定位仪在特定的脑区照射一定波长的冷光源，从而激活微血管内的凝血机制，引

7、起光照局部形成血栓。适用于一些溶栓药物的脑保护作用的研究。 16（二）局部脑缺血的模型 18大鼠脑血管解剖示意图（红线表示栓线的插入位置）17大鼠脑血管解剖示意图（红线表示栓线的插入位置）19（三）离体实验模型 离体的脑片及培养细胞结合给予低糖及低氧孵育、或化学试剂的处理均可以作为模型，可用于研究缺氧缺血性神经元死亡机制和药物的保护作用。 18（三）离体实验模型20第二节 急性缺血性神经细胞损伤及其死亡的机制 一、缺血致神经细胞膜电位及离子浓度的变化二、谷氨酸神经毒理论三、神经元的DNA氧化损伤 四、细胞因子对缺血性神经元的损伤作用五、缺血性神经元的凋亡及其调节 19第二节 急性缺血性神经细胞

8、损伤及其死亡的机制 一、缺血致神一、缺血致神经细胞膜电位及离子浓度的变化脑缺血引起能量供给障碍，很快引起神经细胞膜电位及细胞膜内外离子浓度的变化。在缺血后15-90秒之内，不同脑区的神经细胞膜电位变化不一，如海马CA1和CA3区的神经细胞表现为先超极化，继之去极化，而齿状回的细胞则表现为去极化。 20一、缺血致神经细胞膜电位及离子浓度的变化脑缺血引起能量供给障实验进一步证明了去极化是与K通道功能传导增加有关。 在神经细胞缺氧的最初数分钟内，细胞膜内外的大多数离子浓度差变化缓慢，但是K变化较为明显，导致细胞膜产生去极化（-20mV），引起所谓的低氧性去极化反应（anoxic depolariza

9、tion）。 当缺氧达3-5分钟时，细胞外K从3-9mM上升到50-80mM，伴细胞间隙中Na、Cl和Ca2的含量下降。此时细胞外Na为60-70mM，Cl75-90mM，Ca2 -0.1mM。 21实验进一步证明了去极化是与K通道功能传导增加有关。 23（一）钾通道在缺氧性神经元损伤中的作用参与缺氧损伤神经元病理过程的主要钾通道有ATP敏感钾通道钙依赖性钾通道延迟外向钾通道在缺氧性神经元损伤中钙依赖性钾通道的作用比较复杂，ATP敏感钾通道开放对神经元具有保护作用，而延迟外向钾通开放则导致神经元发生凋亡。 22（一）钾通道在缺氧性神经元损伤中的作用24（二）钠通道在缺氧性神经元损伤中的作用 电

10、压依赖性钠通道可介导瞬态钠电流和持续钠电流两种钠电流。在缺氧情况下，这两种钠电流的变化对缺氧性神经元损伤有截然相反的作用。 瞬态钠电流降低对细胞可能具有保护作用。增加持续钠电流将加剧细胞损伤。23（二）钠通道在缺氧性神经元损伤中的作用 25（三）钙通道在缺氧性神经元损伤中的作用Ca2+参与细胞表面生物电现象和细胞内的生化过程。Ca2+内环境稳定，主要靠胞膜对Ca2+极低的通透性和依赖能量将钙从细胞内主动排出（钙泵）来维持。Ca2+的内流主要通过电压门控性钙通道和受体启动的钙通道，以及通过细胞内第二信使的内在机制和神经递质的作用。 电压门控性钙通道可由受体启动的钙通道来调控，而后者N-甲基-D型

11、天冬氨酸（NMDA）受体也受电压依赖活动的影响，细胞膜的Na+-Ca2+交换系统、线粒体膜钙泵系统与内质网的运转系统起了重要的调节作用。 24（三）钙通道在缺氧性神经元损伤中的作用26脑缺血缺氧后能量衰竭，ATP生成不足，电压门控性钙通道开放，细胞内Ca2+增加。缺血后细胞间隙释放增多的谷氨酸作用于NMDA受体，激活受体启动的钙通道，也引起Ca2+内流。细胞兴奋时，细胞内腺苷酸环化酶的增加，鸟苷酸环化酶的降低，以及去甲肾上腺素的作用，使线粒体的Ca2+释放，而已进入细胞内的Ca2+又激活细胞内贮存的Ca2+使细胞内Ca2+饱和。 25脑缺血缺氧后能量衰竭，ATP生成不足，电压门控性钙通道开放，

12、钙内流的影响： 当脑血管平滑肌内的Ca2+上升至一定浓度时，导致血管平滑肌收缩使血管痉挛，从而更减少了缺血后脑组织的CBF，加重了缺血。 游离的Ca2+进入细胞内造成细胞内各种钙依赖性酶反应被无秩地激活，使细胞膜的磷脂被分解，产生游离脂肪酸引起细胞膜受损；而游离脂肪酸更激活前列腺素系统，促进自由基产生，引起不可逆性细胞损害。 26钙内流的影响： 28细胞内钙超载是造成缺氧神经元进一步损伤和致死的重要环节。尽管大量的研究表明，细胞内钙超载是缺血性神经元死亡的主要机制之一，但是早期的实验并没证明钙通道拮抗剂具有明显的神经元保护作用。其原因可能与药物对离子通道蛋白的选择性有关。 27细胞内钙超载是造

13、成缺氧神经元进一步损伤和致死的重要环节。尽管二、谷氨酸神经毒理论（一）脑缺血致突触间隙谷氨酸含量升高谷氨酸是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质。在正常情况下，谷氨酸在突触间隙内的含量维持是依赖于突触前膜的正常释放和神经元与胶质细胞的再摄取过程来完成的。 突触间隙谷氨酸含量升高反映多种可能性，即释放增加或再摄取障碍，或两者兼有之。 28二、谷氨酸神经毒理论（一）脑缺血致突触间隙谷氨酸含量升高30（二）谷氦酸受体的兴奋性与缺血性神经元死亡脑缺血引起谷氨酸在突触间隙的堆积，从 而过度兴奋谷氨酸受体导致神经元死亡。 谷氨酸受体的分类及其特性 离子型谷氨酸受体(ionotropic glutamate

14、receptors, or ligand-gated ion channels): NMDA（N-methyl-D-asparate）、AMPA（-amino-3-hydrosy-methyl-isoxazole-4-propionate）和KA（kainate）受体 代谢型谷氨酸受体（metabotropic glutamate receptors）：有8种亚型，为mGluR1-8 。29（二）谷氦酸受体的兴奋性与缺血性神经元死亡31图4-1 离子型及代谢型谷氨酸受体分类及其作用方式示意图 30图4-1 离子型及代谢型谷氨酸受体分类及其作用方式示意图 31.代谢型谷氨酸受体：可分为三类：第一

15、类由mGluR1和mGluR5组成(激活PKC)；第二类由mGluR2和mGluR3组成；第三类由mGluR4、mGluR6、mGluR7和mGluR8组成。 mGluR分布于突触前和突触后膜上，功能研究表明，mGluR激动剂本身没有明显的神经细胞毒的作用，但可通过激活PKC的活性，调节离子型谷氨酸受体激动剂的毒性作用。 311.代谢型谷氨酸受体：332.离子型谷氨酸受体 （1）AMPA受体： AMPA受体在脑内分布广泛，其分布区域与NMDA较一致。AMPA受体兴奋后，主要参与突触后膜兴奋性电位的快速反应过程。当AMPA受体兴奋时，其中GluR1、GluR3和GluR4亚单位参与细胞膜对钙离子

16、的高通透性作用，而GluR2则相反。GluR2的存在具有抑制AMPA受体兴奋所引起的钙通道打开作用。 GluR2在脑内的分布量很高，并具有抑制钙离子通道的通透作用。此外，药物引起AMPA受体兴奋时，该受体会产生快速的去敏反应。AMPA受体GluR2的这些生物学特性都有助于降低谷氨酸兴奋性神经毒的作用。 322.离子型谷氨酸受体 34（2）KA受体：KA受体在中枢神经内分布较集中，仅分布于海马、下丘脑和小脑颗粒细胞层等。KA受体由3个亚单位构成，它们分别是GluR5、GluR6和GluR7。由于缺少特异的KA受体激动剂或拮杭剂，因此对KA受体的功能研究相对较少。 33（2）KA受体：KA受体在中

17、枢神经内分布较集中，仅分布于海马（3）NMDA受体：NMDA受体在脑内分布广泛。在正常情况下，NMDA受体参与认知、学习和记忆功能。 NMDA受体由二组亚单位构成，即NR1和NR2， NMDA受体是以NR1和NR2复合形式行使其功能， NR1亚单位可能是NMDA受体发挥生物效应的必需结构蛋白，而NR2亚单位被认为是NMDA受体的调节蛋白。34（3）NMDA受体：NMDA受体在脑内分布广泛。在正常情况下在NMDA受体上，至少有5个不同的调节部位，如NMDA受体激动剂谷氨酸结合部位（agonist glutamate binding site）、甘氨酸结合部位（co-agonist glycine

18、 binding site）、PCP结合部位、电压依赖Mg2结合部位（voltage-dependent Mg2site）、Zn2+结合部位（Zn2+ site）。其中Mg2，Zn2+，PCP具有抑制NMDA受体兴奋性作用，而甘氨酸则可增强NMDA受体激动剂的反应性 。 NMDA受体兴奋后，打开配体门控离子通道，使细胞外钙流入胞内，钙的内流参与了NMDA受体兴奋性传递作用，同时也是造成谷氨酸细胞毒的主要机制之一。35在NMDA受体上，至少有5个不同的调节部位，如NMDA受体激（4）谷氨酸受体阻断剂在缺血性神经元损伤中的保护作用 在缺血性神经细胞死亡过程中，谷氨酸受体中以NMDA受体的作用最为突

19、出。采用NMDA受体竞争性和非竞争性拮抗剂，甘氨酸拮抗剂，多胺拮抗剂，二价离子如Mg2+和Zn2+均可以在不同程度上阻止缺血性神经元的死亡。 AMPA/KA受体拮抗剂在脑缺血神经元损伤中也具有神经保护作用。 36（4）谷氨酸受体阻断剂在缺血性神经元损伤中的保护作用 38（三）谷氨酸载体参与缺血性神经元损伤病理反应 谷氨酸的代谢主要依赖谷氨酸载体的再摄取。脑缺血后，缺血边缘脑区的神经细胞上谷氨酸载体再摄取活性增加，表达均增加，包括神经胶质和神经元，这很可能作为一种机体的自身保护机制参与该病理反应过程。 若采用药物抑制谷氨酸载体的活性，或者用反义寡核苷酸阻断谷氨酸载体的蛋白生物合成，则明显地加剧脑

20、缺血后引起的神经元死亡和扩大缺血性脑梗死灶。 37（三）谷氨酸载体参与缺血性神经元损伤病理反应 39（四）谷氨酸兴奋性神经毒的分子机制包括细胞受体离子通道、细胞内信号转导系统、胞内核因子、DNA的修复过程等环节。 38（四）谷氨酸兴奋性神经毒的分子机制40谷氨酸与NMDA受体结合后，打开Ca2+通道，使细胞外Ca2+进人细胞内可直接产生超氧阴离子(O2-)，Ca2+与钙调蛋白（calmodulin, CaM）结合，一方面激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)活性，另一方面激活钙神经素（calcineurin），后者使NOS去磷酸化进一步激活NOS，从而产生的N

21、O-，O2-和NO-结合形成ONOO-，后者可造成DNA损伤和抑制线粒体的呼吸链功能，产生ATP功能障碍，使细胞内一些ATP依赖泵功能障碍，同时使体内的自由基大量生成，尤其是羟自由基（OH），后者可攻击核苷酸，造成DNA损伤。损伤的DNA激活PARS（poly ADP-ribosesynthase），加剧能量耗竭，最终导致神经元死亡。同时损伤的DNA可以激活细胞内的自身修复机制。当修复能力大于损伤时，细胞得以存活，反之，细胞则死亡。39谷氨酸与NMDA受体结合后，打开Ca2+通道，使细胞外Ca2图4-2 谷氨酸神经毒作用机制示意图 40图4-2 谷氨酸神经毒作用机制示意图 424143三、神经

22、元的DNA氧化损伤 大脑是人体所有脏器中代谢速率最高的器官，其代谢所需的能量主要由氧化代谢产生。然而，氧化代谢过程中会产生各种活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS），后者将攻击细胞内的蛋白、脂质及核苷酸等成分，造成氧化应激损伤，其中以核苷酸或DNA损伤较为突出。 正常细胞代谢过程中产生的DNA损伤可以通过自身修复被完全消除。 在脑损伤或异常的情况下，DNA的氧化损伤程度加剧，大大超过自身正常的修复能力，造成神经细胞内损伤DNA的堆积，从而使细胞退化或死亡。 42三、神经元的DNA氧化损伤 大脑是人体所有脏器中代谢速率最高（一）自由基的正常代谢 自由基是指外层轨

23、道具有不配对电子的原子、原子团、离子和分子。自由基广泛存在于各种生物体内，它异常活泼，可与生物大分子，特别是细胞膜上的不饱和脂肪酸反应，形成脂质过氧化物（LPO）破坏生物膜。生物体内的自由基以含氧自由基为主，主要包括：超氧阴离子（O2-）、羟自由基（OH）、单线态氧（1O2）、一氧化氮（NO）等。正常情况下脑组织清除自由基靠两个方面，即酶和天然的抗氧化剂。 43（一）自由基的正常代谢 45（二）自由基参与缺血性神经细胞损伤的病理过程 脑缺血再灌注脑内产生大量自由基。其中OH是活性最高、毒性最大的一种自由基，而且其它多种自由基也可最终生成OH而发挥其毒性作用。 1.缺血损伤脑内自由基的生成途径：

24、（1）黄嘌呤氧化酶系统的活化：ATP 降解 次黄嘌呤黄嘌呤氧化酶 黄嘌呤+尿酸+O2- 此途径是缺血再灌注后产生自由基的主要途径，生成的O2-可以在金属离子的催化下生成毒性更大的OH。 44（二）自由基参与缺血性神经细胞损伤的病理过程 46（2）花生四烯酸的代谢：膜磷脂 降解 花生四烯酸(AA)环氧化酶/脂氧化酶前列腺素(PGs)/白三烯(LTs)+O2- （3）NO途径：钙升高间接激活NO合酶的活性，生成NO。在缺血再灌中由于大量超氧化物的生成，NO可以与之反应 ，具有毒性。 （4）吞噬细胞的呼吸链代谢：吞噬细胞对氧的摄取量增加，细胞中NADPH氧化酶活性增高，将O2还原为O2- 。 （5）

25、其它：线粒体与微粒体可以将小部分的O2还原为O2- 。儿茶酚胺类递质自身氧化的同时也形成自由基。 45（2）花生四烯酸的代谢：472.缺血损伤时脑内的DNA氧化损伤 在生理条件下，由于脑代谢过程中产生大量自由基ROS。后者通过DNA链间或DNA与蛋白质之间的交链反应，或通过对核苷酸碱基的化学修饰，从而使DNA链的单链和双链断裂，或糖苷键的裂解等造成细胞的DNA氧化损伤。 462.缺血损伤时脑内的DNA氧化损伤 48图4-3 DNA氧化损伤产生的主要部位示意图OH和活性氧簇攻击邻近DNA可形成：（1）攻击碱基引起碱基损伤；（2）攻击糖苷键产生AP位点损伤；（3）攻击磷酸键引起DNA键断裂，可发生

26、在3-OH末端（3a）或3-PO4末端（3b）；（4）攻击核糖产生3-PG末端损伤 47图4-3 DNA氧化损伤产生的主要部位示意图49正常脑内每时每刻都有大量的DNA的损伤和修复的存在，大脑有强大的DNA的修复能力以及对DNA损伤的耐受性。短暂脑缺血后，脑内氧化DNA损伤可增加5倍以上，而DNA修复活性仅增加约3倍，再灌3小时后仅有85左右的氧化DNA损伤可被消除。因此，氧化DNA损伤的形成大大超过了DNA的修复能力，成为脑缺血性神经元死亡的病理原因之一。在体外实验发现，ROS可以诱发氧化DNA损伤的类型约达100种。如果这类损伤得不到及时的修复，将在转录和复制过程中引起链延长终止或编码属性

27、的改变，则将造成神经细胞的退行性变或突变。48正常脑内每时每刻都有大量的DNA的损伤和修复的存在，大脑有强图4-4 氧化应激损伤时脑内核苷酸损伤的常见类型 49图4-4 氧化应激损伤时脑内核苷酸损伤的常见类型 51四、细胞因子对缺血性神经元的损伤作用细胞因子（cytokines）是一个存在体内自然产生的蛋白，包括白介素-1（interleukin-1, IL-1）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）等。它参与细胞的感染、炎症、自身免疫、外伤或缺血损伤后的防御反应。50四、细胞因子对缺血性神经元的损伤作用细胞因子（cytokin大脑中动脉主干闭塞：表现为对侧偏瘫

28、、偏身感觉障碍和偏盲。可分为三类：第一类由mGluR1和mGluR5组成(激活PKC)；在出生以后脑内神经元的数目和类型就不再发生变化；同时损伤的DNA可以激活细胞内的自身修复机制。KA受体由3个亚单位构成，它们分别是GluR5、GluR6和GluR7。bcl-2具有很明显的神经细胞保护作用。突触间隙谷氨酸含量升高反映多种可能性，即释放增加或再摄取障碍，或两者兼有之。二、脑梗死的临床表现梗死的边缘区又称为半影区（penumbra）。mGluR分布于突触前和突触后膜上，功能研究表明，mGluR激动剂本身没有明显的神经细胞毒的作用，但可通过激活PKC的活性，调节离子型谷氨酸受体激动剂的毒性作用。a

29、ctin被降解时DNAase I活性也增加，使DNA的双链断裂，造成细胞及细胞核的破坏。如果这类损伤得不到及时的修复，将在转录和复制过程中引起链延长终止或编码属性的改变，则将造成神经细胞的退行性变或突变。脑缺血后引起脑内谷氨酸生物转换功能加强，细胞内Ca2超载，自由基大量生成，造成DNA损伤，最终导致缺血神经元的死亡。凋亡细胞具有其自身的病理特征，根据其特征可采用相应的研究手段加以观察 ：谷氨酸是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质。IL-1可能通过caspase及iNOS-NO介导通路发挥其生物效应 。（一）白介素-1及其受体 IL-1分为IL-1与IL-1两种。相似处：分子量、结构、生物活性

30、。不同处：它们分别来源于两个不同的前体基因 。生物合成后的IL-1大部分仍保持膜结合特性；而IL -1则分泌发挥作用，IL-1通过与靶细胞表面的特异受体结合来发挥活性。IL-1原（pro-interleukin-1）本身是无活性的前体，通过白介素-1转换酶（interleukin-1 converting enzyme, ICE）的水解形成有活性的IL-1。 51大脑中动脉主干闭塞：表现为对侧偏瘫、偏身感觉障碍和偏盲。（一IL-1受体可分为两种，即I型与型。结构：均含胞内和胞外结构两部分。两种受体的胞外结构均含有三个免疫球蛋白样结构域，而胞内结构具有很大的差异。 功能：IL-1 I型受体兴奋时

31、，激活信号转导通路发挥作用 ；IL-1 型受体对信号转导通路无作用，但具有抑制IL-1的生物活性作用。 分布：这两种受体的分布并不完全一样，具有动物的分布差异，如IL-1受体主要分布在小鼠，而IL-1受体则主要在大鼠。52IL-1受体可分为两种，即I型与型。54（二）白介素-1作用的信号转导通路及其与神经损伤细胞因子与其受体结合可激活胞内信号转导通路 ，包括诱导磷脂水解，细胞内腺苷酸环化酶升高，蛋白酪氨酸磷酸化；IL-1还可激活磷酸质酯酶，特异地通过神经鞘磷脂（sphingomyeline）产生神经酰胺（ceramide）；IL-1可能通过caspase及iNOS-NO介导通路发挥其生物效应

32、。53（二）白介素-1作用的信号转导通路及其与神经损伤55图4-5 白介素-l作用的信号转导通路示意图54图4-5 白介素-l作用的信号转导通路示意图56 IL-1在神经细胞损伤和保护方面的调节作用 ：整体研究：缺血损伤时脑内IL-1的高表达可能不利于神经元的保护效应。 离体研究：离体神经细胞培养的研究则获得完全相反的结果。 离体及整体实验研究的矛盾结果提示，IL-1的直接和间接作用机制具有很大的差异，其原因更有待于深人研究。 55 IL-1在神经细胞损伤和保护方面的调节作用 ：57五、缺血性神经元的凋亡及其调节在形态、生化、细胞和分子生物学各方面的研究证明，缺血损伤的神经元死亡方式，不仅仅是

33、坏死，也存在凋亡。一般认为，脑缺血引起的急性期神经元死亡是以坏死（necrosis）为主，而继发性死亡（secondary neuronal death）或迟发性死亡（delayed neuronal death）则以凋亡为主，前者发生在缺血后较早的中心区，后者多发生在缺血几天以后的半暗区。56五、缺血性神经元的凋亡及其调节在形态、生化、细胞和分子生物学TTC染色示局部脑缺血57TTC染色示局部脑缺血59细胞凋亡（apoptosis）：是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等

34、的作用；它在生理及病理条件下均存在。细胞发生凋亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，对于这种生物学观察，借用希腊“Apoptosis”来表示，意思是像树叶或花的自然凋落，可译为细胞凋亡。58细胞凋亡（apoptosis）：是指为维持内环境稳定，由基因（一）缺血性神经元的凋亡现象 凋亡细胞具有其自身的病理特征，根据其特征可采用相应的研究手段加以观察 ：用凝胶电泳的技术可观察到典型的梯形条带，以反映组织中DNA断裂的情况； 用3-末端标记的原位杂交技术观察TUNEL染色阳性细胞，以反映细胞内DNA的断裂； 用不同的组织染色法结合电镜或光镜观察技术，可以反映细胞核膜情况、核仁破裂及凋亡小体； 用特异性标

35、记的手段可观察有关凋亡因子的变化。 许多实验研究从形态、生化和功能分析不同角度都表明缺血后确实存在神经元的凋亡过程。 59（一）缺血性神经元的凋亡现象61凝胶电泳显示凋亡细胞DNA片段lane A:对照组; lane 肢体缺血组; lane C:脑缺血组; lane D: LIP group60凝胶电泳显示凋亡细胞DNA片段lane A:对照组; laTUNEL染色神经元细胞凋亡细胞(细箭头)，坏死细胞(粗箭头)40061TUNEL染色神经元细胞凋亡细胞(细箭头)，坏死细胞(粗箭脑缺血海马CA1区染色A: Caspase-3免疫染色200B: Caspase-3 mRNA原位杂交200 62脑

36、缺血海马CA1区染色A: Caspase-3免疫染色2CA1区bax阳性神经元200CA3区bcl-2阳性神经元20063CA1区bax阳性神经元200CA3区bcl-2阳性神经元（二）参与缺血性神经元凋亡的因子细胞的凋亡被认为是一个主动过程，是通过合成某些新的蛋白质而实现的。目前认为，参与这些调转的内部因子很多。在中枢神经系统，参与缺血性神经细胞凋亡基因研究最多的可概括成两大类：即bcl-2家族和Caspases家族。其他还包括p53，NF-B等。 64（二）参与缺血性神经元凋亡的因子66 1.Caspases族调亡基因Caspases作为半胱氨酸(cysteine)蛋白水解酶，使无活性的P

37、ro-IL-1（Pro-interleukin-1）水解成有活性的IL-1，因此曾具有ICE（即白介素-1转换酶, interleukin-1 converting enzyme）之称。Caspases还可特意地水解Asp-X肽链，形成大小不等的有生物活性的片段，从而行使或执行凋亡指令。Caspeses本身有以酶原的形式存在于体内，又可作为这类酶的底物被水解成有生物活性的蛋白分子。根据其生物特性命名为cysteine aspartate-specific proteinases简称Caspases。目前认为Caspases主要有Caspasesl-10共10种。 65 1.Caspases族调

38、亡基因67表4-1 Caspases的命名及其底物和酶抑制剂66表4-1 Caspases的命名及其底物和酶抑制剂68采用基因敲除或基因突变的技术研究表明，Caspases在凋亡过程中各自行使其不同的作用。其中Ced-3及Ced-4是最早被发现并证明具有促进细胞凋亡作用的基因，而Ced-9则是最早被发现的具有抑制凋亡作用的基因。 根据表4-1可以看出，很多酶的底物本身参与DNA的修复或RNA的合成作用。不难理解当这些底物在酶的催化下裂解而丧失原有的修复功能，进一步加剧细胞的损伤。又由于这些底物多分布于细胞核上，当自身降解后往往导致细胞形态学上的变化，包括染色体浓缩及DNA断裂的片段形成。 67

39、采用基因敲除或基因突变的技术研究表明，Caspases在凋亡图4-6 Caspases基因线虫细胞凋亡的调节作用示意图采用基因突变技术研究提出细胞凋亡过程可分成四个阶段，即死亡决定期(decision to die)；死亡执行期(execution to death)；死亡细胞清理期(engulfment)及死亡细胞消化期(degradation)。Caspases及有关基因作用在第一期，仅引起少数细胞凋亡，而作用在以后的三期内则导致所有细胞的凋亡。 68图4-6 Caspases基因线虫细胞凋亡的调节作用示意图7具有修复作用的底物主要有： （1）PARP是DNA修复酶：参加由p53诱导的DN

40、A链断裂的修复。PARP被Caspases-1，4，6，7分别酶解后，其DNA的修复作用也被阻止。 （2）DNA-PK（DNA-dependent protein kinase）：主要DNA采纳于双链断裂的修复。当Caspases-3酶活性增加使DNA-PK的活性消失，导致细胞损伤后DNA的修复能力的抑制。 69具有修复作用的底物主要有： 71 （3）actin：是重要的细胞骨架蛋白。actin被降解时DNAase I活性也增加，使DNA的双链断裂，造成细胞及细胞核的破坏。 （4）lamins：是细胞核骨架蛋白，抑制lamins降解对染色体浓缩无作用，但是可以预防细胞核的皱缩及DNA的断裂。

41、（5）hn RNP(heteronuclear ribonucleoproteins)：参与RNA的延长和蛋白质的转录过程，从而抑制凋亡的启动。但是，当Caspases降解hn RNP后，hn RNP的这一作用遭到破坏。70 （3）actin：是重要的细胞骨架蛋白。actin被降解时2.脑缺血后神经细胞内Caspases活性变化与神经元存亡的相关分析 Caspases-1酶原(proenzyme) 水解(Caspase-l、3参与) 有活性的Caspase-1(白介素-1转化酶, ICE) 水解Pro-IL-1 有生物活性的小分子IL-1，参与炎症及细胞凋亡导致缺血后神经细胞的死亡。脑缺血后，

42、脑内的IL-1增加；脑内ICE及IL-1 mRNA和Caspases-1及Caspases-3的表达均增加；Caspases-1mRNA及Caspases-3mRNA的表达增加。712.脑缺血后神经细胞内Caspases活性变化与神经元存亡的Caspases参与凋亡调节： 用Caspases酶活性抑制剂z-VAD可明显地抑制脑缺血所引起的ICE和IL-1变化，以及DNA的降解作用； 用转基因动物观察到抑制神经元内Caspases-1表达或ICE基因突变后，不仅缩小脑缺血引起的脑梗塞灶，而且减轻神经功能障碍；采用非选择性Caspase抑制剂及相对选择性Caspase-1及Caspase-3抑制剂

43、，研究结果两者均有明显的脑保护作用，包括缩小缺血性脑梗塞体积和减轻神经功能的退化。Caspase基因参与了缺血后的神经元凋亡过程，IL-1不仅参与炎症性神经元的死亡，而且也参与凋亡过程。 72Caspases参与凋亡调节： 743.Bcl-2基因族调亡抑制因子及其促进因子Bcl-2是由一族蛋白质构成，其结构上均含两个以上结合区，即BH1，BH2或BH3，功能上又将bcl-2族蛋白分成凋亡诱导因子（apoptosis inducers）包括bax，bcl-x5，bad，bak，bik，以及凋亡抑制因子（apoptosis inhibitors）如bcl-2，bcl-xl，mcl-1。 Bcl-2

44、对正常细胞的功能和代谢几乎无明显影响，但对病理性细胞的凋亡具有一定的抑制作用。 733.Bcl-2基因族调亡抑制因子及其促进因子75这族蛋白的功能通常以二聚体蛋白存在的形式而决定。当bcl-2与bcl-2的二聚体形式存在时，则发挥抑制细胞凋亡的生理功能，而当bcl-2与bax，或bcl-2与bad形成二聚体后，则bcl-2的抑制凋亡作用被取消，从而促进凋亡发生。 BH1和BH2与bcl-2二聚体蛋白形成有关，而BH3则对bax，bak及bip二聚体形成有重要意义，因此被认为具有促进凋亡作用的结合区。 bcl-2蛋白的磷酸化可以影响其功能和细胞内分布。 74这族蛋白的功能通常以二聚体蛋白存在的形

45、式而决定。当bcl-2bcl-2抑制细胞凋亡的机制：抑制细胞膜上脂质过氧化物的形成，从而阻止氧化应激导致的细胞凋亡。 对线粒体膜通透性的调节。在凋亡过程中bcl-2可稳定线粒体功能，提高细胞对缺血损伤的耐受能力。抑制线粒体释放细胞色素c。抑制Ced-4致细胞凋亡作用。在研究Caspases的凋亡机制中，最最常用的实验模型是C.elegans线虫。75bcl-2抑制细胞凋亡的机制：774.Bcl-2对缺血性神经元的保护作用 bcl-2具有很明显的神经细胞保护作用。虽然，bcl-2在脑缺血中的作用研究得还是很初步的，但是其结果已经显示bc1-2在阻止损伤性神经元死亡中起相当重要的作用。 在全脑缺血

46、实验动物模型上观察到，缺血后导致海马CA1区的神经元死亡，而海马CA3区和齿状回的神经元仍然存活。bcl-2仅表达在海马CA3区和齿状回的存活的神经元上，而bax凋亡基因则表达在海马CA1区注定要死亡的神经元上； 用NMDA受体拮抗剂可以明显地增加缺血的边缘区bc1-2蛋白表达，同时增加该区域存活的神经元；764.Bcl-2对缺血性神经元的保护作用 78采用抗自由基的处理，使缺血再灌注区羟自由基生成量减少，bcl-2表达阳性的细胞明显增加，同时产生显著的细胞保护作用；转基因动物实验研究证明，bcl-2的过量表达可以预防缺血引起的神经元的凋亡；在培养的神经元上所进行的研究表明，使bcl-2高表达

47、的神经元具有抵抗谷氨酸神经毒、高钙或自由基堆积致细胞死亡的作用。从整体和离体不同水平、不同角度说明bcl-2在缺血性神经元损伤中具有一定的细胞保护作用，但是 bcl-2在脑缺血中的神经保护作用机制有待进一步阐明。77采用抗自由基的处理，使缺血再灌注区羟自由基生成量减少，bc（三）缺血神经元凋亡的线粒体机制 线粒体在缺血性神经元凋亡过程中起十分关键的作用，许多参与凋亡调节的因子分布在线粒体，或由线粒体调节释放。 缺血损伤时，自由基堆积，产生DNA的氧化损伤。诱导和激活了细胞内参与凋亡的途径中的各种因子（bcl-2二聚体解聚，激活了bax或bid），线粒体膜电位超常去极化，释放线粒体释放蛋白（如细

48、胞色素C、凋亡诱导因子AIF和smac/DIALO蛋白），以不同的作用方式发挥其促凋亡的作用。 78（三）缺血神经元凋亡的线粒体机制 80当Cyt C释放后，以2:1的形式与Apaf蛋白形成复合体，后者使无活性的caspase-9水解形成有活性的caspase-9，继而形成Cyt C-Apaf-caspase-9复合体，从而激活caspase-3；当活化的smac/DIALO蛋白从线粒体释放后，其N-末端与凋亡抑制蛋白（apoptosis inhibiting protein, AIP）结合，从而取消AIP对caspase-9和caspase -3的抑制效应，导致细胞凋亡；AIF是一种线粒体释

49、放的caspases非依赖的凋亡诱导相关蛋白 。79当Cyt C释放后，以2:1的形式与Apaf蛋白形成复合体，图4-7 缺血损伤神经细胞凋亡调节通路示意图80图4-7 缺血损伤神经细胞凋亡调节通路示意图82第三节 神经细胞的内源性保护 脑缺血后引起脑内谷氨酸生物转换功能加强，细胞内Ca2超载，自由基大量生成，造成DNA损伤，最终导致缺血神经元的死亡。当机体受到各种有害侵袭时，往往会有一些内源性保护反应，以实现机体的自身保护。目前已经了解到脑内存在一些自身保护机制。概括地讲，这些机制主要包括内源性保护因子和内源性修复两大方面。 81第三节 神经细胞的内源性保护 脑缺血后引起脑内谷氨酸生物转一、

50、内源性保护因子 当大脑受到各种损伤时，脑内除激活诱导细胞死亡的因子分泌外，同时激活脑内的保护因子。这些内源性神经保护因子包括神经营养因子，抗氧化防御系统中的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、谷胱甘肽过氧化物（glutathione peroxidase）、金属离子转运结合蛋白、抑制性神经递质GABA、腺苷、细胞因子中的内源性IL-1拮抗剂、IL-10、热休克蛋白、雌激素、谷氨酸受体GluR2亚型、谷氨酸载体以及凋亡抑制因子等。当它们的功能加强时，具有明显的神经细胞保护效应。 82一、内源性保护因子 84二、内源性修复机制（一）缺血损伤神经细胞内DNA的修复D

51、NA修复机制及其通路十分复杂。DNA的修复通路大致分为以下几种：一步反应修复和多步反应修复。 多步反应修复包括碱基切除修复、核苷酸切除修复和双链DNA损伤修复。这类DNA的修复往往需要许多蛋白和酶的参与（包括参与DNA双链断裂识别的蛋白、参与剪切修复的复合蛋白和双螺旋蛋白等 ），并形成有功能的复合体共同配合修复。 DNA损伤后，其损伤区首先被识别，而后被剪切剔除，再行缺口修补、连接等步骤。 83二、内源性修复机制85缺血损伤时脑内DNA修复功能加强，表现在早期DNA的掺入增加、多种DNA的修复因子表达功能加强（包括剪切修复和转录修复因子）。 动物个体间的DNA修复能力有很大的差异，但是细胞核和线粒体内都存在DNA氧化损伤及其修复，而且其修复速率是基本相同的。 神经细胞内的DNA究竟是如何修复的还有待进一步解决。 84缺血损伤时脑内DNA修复功能加强，表现在早期DNA的掺入增加（二）神经元的再生修复 长期以来人们一直认为成年哺乳动物的脑在生理情况下是一个极其稳定的器官。在出生以后脑内神经元的数目和类型就不再发生变化；受到损伤后，脑内神经元的数目只会减少进而导致脑的功能受损。 然而近半个世纪来的研究表明，成年哺乳动物的脑同