胰蛋白酶催化罗丹明110双酰胺衍生物荧光酶联免疫吸附方法检测桔青霉素

1、胰蛋白酶催化罗丹明110双酰胺衍生物荧光酶联免疫吸附方法检测桔青霉素桔青霉素(citrinin，CIT)是一种由青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)和红曲霉属(Monascus)中的部分菌株产生的聚酮类真菌毒素，其主要存在于储存的谷物中1。特别在气候较炎热的国家生产的谷物，CIT的污染是一个严重问题2。谷物产品和其他具有药用价值的植物在生长、收获、运输和储存过程中可能会被产生CIT的真菌污染3-4。当处理和储存条件没有得到严格控制时，水果也易被CIT污染而造成重大损失。根据调查，工业化国家的作物收获后损失约为25%，其他国家超过50%5。而且CIT被证明对动物具有

2、较强的肾毒性以及潜在的遗传毒性、胚胎毒性6和致畸性7。鉴于其对人类健康及经济发展的危害，开发一种灵敏、快速的CIT检测方法显得非常重要。日本厚生省在2000年版的“日本食品添加剂标准”中率先制定出红曲色素中CIT限量标准为0.2 mg/kg，这一标准是当时能够检出的CIT的最低剂量8，欧盟规定CIT在红曲霉发酵的大米补充剂中的限量标准为2 mg/kg，中国台湾省制定的食品中真菌毒素限量标准规定了食品中CIT的限量，其中红曲色素中CIT的限量为0.2 mg/kg、原料用红曲米的限量为5 mg/kg以下，使用红曲原料制成的食品为2 mg/kg以下8。目前在中国大陆地区，还没有建立不同农产品中CIT

3、含量的控制指标。目前，CIT检测可用的分析方法有薄层色谱法9、高效液相色谱法(HPLC)10、液相色谱串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)11、超高效液相色谱和荧光检测法12、气相色谱质谱法13和酶联免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)14。薄层色谱法虽然操作简单，但是准确性和特异性较差；HPLC等仪器检测方法虽然灵敏度和稳定性较高，但样品前处理操作较为复杂，且需要专业的大型仪器和检测场所，不能满足食品安全快速检测要求。ELISA作为一种灵敏度高、高通

4、量、设备简单、成本低的样品筛查和定量方法，近年来得到了迅速发展和广泛应用。基于辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)催化底物的比色ELISA法存在灵敏度低、抗基质干扰能力差的局限性。荧光酶联免疫分析法(fluorescein-linked immunosorbent assay，FELISA)与现有的分析平台兼容性良好，被认为是目前有害食源性物质筛选最敏感的方法之一15-16。在过去的几十年里，已开发出多种具有高灵敏度的FELISA用于检测目标分子，包括基于碱性磷酸酶的化学发光免疫检测17、基于HRP的化学发光免疫检测18、基于过氧化氢酶的荧光免疫检测19、基

5、于人凝血酶的荧光免疫检测20等，具有更广泛的应用前景。因此，建立一种具有高灵敏度的FELISA方法用于谷物中CIT的定量检测具有较大的应用前景。胰蛋白酶(trypsin)是一种高特异性的丝氨酸蛋白水解酶，对于含精氨酸(Arg)位点的肽段表现出非常高的水解催化性能21。基于trypsin的这个特性，研究人员设计并合成了含氨基保护基的三肽Cbz-Ile-Pro-Arg-OH，再通过酰化反应将Arg的羧基与罗丹明110分子中的2个氨基缩合形成双酰胺底物(Cbz-Ile-Pro-Arg)2-R110，用于trypsin的催化能力测定22。在trypsin的催化下，连接在罗丹明110分子两端的酰胺键迅速

6、发生水解断裂，具有微弱荧光的罗丹明110双酰胺底物转变为具有强荧光的罗丹明110分子，荧光信号强度可以得到极强的提高23。本研究通过将trypsin和罗丹明110双酰胺底物引入到FELISA中，克服实际样本的基质干扰，以实现检测灵敏度提高的目的。本研究通过甲醛加成法24合成了trypsin-CIT，并将其引入到FELISA信号生成系统实现CIT的快速检测。其原理如图1所示，trypsin-CIT可通过抗原-抗体相互作用被固定在酶标孔中，选择trypsin替代常用的HRP作为标记酶，并且选用仅存在极低荧光的罗丹明110双酰胺衍生物作为trypsin的催化底物。通过CIT与trypsin-CIT对

7、其抗体的竞争关系，被固定下来的trypsin催化罗丹明110双酰胺衍生物裂解而触发荧光信号的产生，实现对CIT的快速检测。本研究与传统ELISA的HRP-TMB显色体系进行了对比，显示出较高的分析灵敏度，并将其应用于检测玉米样本，验证了本方法的检测性能和稳定性。图1 Trypsin催化的罗丹明110双酰胺荧光底物 ELISA方法检测CITFig.1 Trypsin-catalyzed rhodamine 110 bis-amide fluorescent substrate ELISA method for the detection of CIT1 材料与方法1.1 材料与仪器胰蛋白酶、链球

8、菌蛋白G, 美国Sigma-Aldrich公司；(Cbz-Ile-Pro-Arg)2-R110赛默飞世尔科技公司； CIT， Fermentek公司；抗CIT腹水， 南昌大学中德联合研究院；脱脂乳， 广东赛国生物科技有限公司；甲醇(色谱纯、分析纯)及常见试剂(分析纯)，西陇科学分有限公司；96孔酶标板， Costar公司。Waters H CLASS/XEVD TQD， 美国沃特世公司；桔青霉素免疫亲和柱， 北京华安麦克生物技术有限公司；Varioskan LUX多功能酶标仪， 赛默飞世尔公司；超纯水仪， 美国密里博公司。1.2 trypsin-CIT与HRP-CIT的制备将5.7 mg tr

9、ypsin溶解于2 mL浓度为1 mmol/L的HCl(pH 3)中，随后向其中逐滴加入10 mg/mL的CIT甲醇溶液100 L，混合均匀后加入200 L体积分数为37%甲醛溶液，37 搅拌反应24 h，即得到trypsin-CIT，同样CIT与HRP反应得到HRP-CIT，反应结束后，置0.01 mol/L PBS中4 透析72 h。1.3 trypsin催化的荧光底物浓度罗丹明110双酰胺荧光底物的浓度对于trypsin催化的FELISA信号强度有着较大影响，因此本研究测定了在相同trypsin质量浓度(400 ng/mL)条件下，荧光底物浓度与trypsin浓度的变化规律，获得最佳目标

10、底物浓度。1.4 trypsin催化的FELISA检测流程将链球菌蛋白G(proteinG)用PBS(pH 8.6)稀释至25 g/mL，每孔100 mL，4 过夜包被，去除孔内液体，用含0.05%吐温-20的磷酸缓冲液进行洗板，重复3次，用PBS(pH 7.4)将抗CIT腹水稀释至20 g/mL，每孔100 L，37 孵育1 h后洗板，加入300 L 1%脱脂乳溶液，37 孵育1 h，加入50 L质量浓度为5.5 g/mL的trypsin-CIT和50 L的待测液，37 孵育30 min后洗板，加入浓度为0.312 5 mol/L的罗丹明双酰胺底物，37 孵育30 min后测定激发波长为49

11、8 nm，发射波长为521 nm时的荧光强度。1.5 trypsin催化的FELISA的精密度与准确性评价分别通过LC-MS/MS和FELISA的方法对加标的阴性玉米样本进行分析，随后根据GB 5009.2222022桔青霉素测定中的样本提取方法：称取10.0 g加有CIT的玉米样本于锥形瓶中，加入50 mL体积分数70%的甲醇水溶液，在涡旋振荡2 min，5 000 r/min离心，取上清液用快速定性滤纸过滤后待检测。取上清液用0.01 mol/L PBS稀释7倍后，进行FELISA检测；另取1 mL上清液加入49 mL 0.01 mol/L磷酸溶液(pH 7.5)混匀，用微纤维滤纸过滤后取

12、20 mL上述溶液过免疫亲和柱净化，将其以12滴/s的流速全部通过亲和柱，再将5 mL 0.01 mol/L磷酸溶液(pH 7.5)也以12滴/s的流速通过亲和柱，待液体排干后，用2 mL甲醇以1滴/s的流速进行洗脱，洗脱液收集至样品瓶中用于LC-MS/MS分析。2 结果与讨论2.1 trypsin催化的荧光底物浓度根据图2-a可得，在trypsin质量浓度固定于400 ng/mL条件下，随着底物浓度升高，trypsin催化底物产生的荧光信号也逐渐升高。结合荧光信号强度，底物浓度为0.156 mol/L时具有明显的荧光信号，故选择了0.156 mol/L为本实验的最终底物浓度。2.2 tryp

13、sin-CIT与trypsin催化性能对比在0.156 mol/L底物浓度下，绘制trypsin、trypsin-CIT浓度与荧光强度关系曲线，如图2-b所示，trypsin和trypsin-CIT质量浓度为25 ng/mL时，trypsin-CIT催化产生的荧光强度为35.42，trypsin催化产生的荧光强度为16.68，可推得酶活损失52.91%。a-trypsin(400 ng/mL)条件下底物浓度与荧光强度关系； b-trypsin、trypsin-CIT浓度与荧光强度关系图2 底物浓度及不同酶浓度对荧光强度的影响Fig.2 Effect of substrate concentra

14、tion, trypsin and trypsin-CIT concentration on fluorescence intensity2.3 trypsin催化的荧光ELISA的检测条件优化实验优化了包被腹水浓度、trypsin-CIT浓度、pH、甲醇浓度、NaCl浓度、免疫孵育时间和酶催化时间等影响FELISA的几个关键参数，以获得高灵敏度和强荧光信号。包被抗体和trypsin-CIT的浓度被认为是影响直接竞争ELISA检测灵敏度的最重要因素。为了提高CIT抗体的生物活性，本实验预先将proteinG包被在酶标板上，定向捕获CIT抗体的Fc片段，从而提高CIT抗体的生物活性。因此本实验设

15、置腹水质量浓度为80、40、20、10 g/mL和trypsin-CIT质量浓度为22、11、5.5、2.75 g/mL进行正交实验，结果如表1，通过(F为阴性条件下的荧光值，F0为50 ng/mL加标条件下的荧光值)反映本方法对CIT的检测灵敏度，并基于F与F0的最大差值与B0的最高值原则选择最佳腹水浓度与trypsin-CIT浓度，根据最佳信号显示，包被腹水质量浓度为20 g/mL、trypsin-CIT质量浓度为5.5 g/mL是最佳条件。表1 棋盘滴定法优化包被腹水浓度和trypsin-CIT浓度Table 1 Optimized coated ascites concentratio

16、n and trypsin-CIT concentration by a checkboard titration method注：*为最佳包被腹水浓度和Trypsin-CITpH、甲醇浓度、NaCl浓度能够通过改变抗原抗体结合位点的活性来影响抗原抗体反应，本实验通过B0=(1-F/F0)100(F为阴性条件下的荧光值，F0为50 ng/mL加标条件下的荧光值)反映加入标准品后的抑制结果，当B0值越大时，表示本方法对于CIT的检测灵敏度越高。如图3-a所示，在pH 6.5时，B0达到最大值，为最佳pH条件。由于CIT分子具有很强的疏水性，为实现对样本中CIT的高回收率提取，需要用含有一定体积分

17、数甲醇的样本提取液，但是待检测溶液中的甲醇体积分数过高时，抗原抗体的反应会受到极大干扰，因此，研究了含不同体积分数甲醇的待检测溶液进行反应的检测结果，如图3-b所示，当甲醇体积分数升高时，B0会逐渐下降，且在甲醇体积分数10%时B0从34.09%降至15.55%，基于这一结果，本实验选择甲醇体积分数为10%为免疫检测最佳条件。在免疫反应过程中，一定浓度的NaCl有利于抗原抗体的相互作用，如图3-c所示，随着NaCl浓度的升高，B0也逐渐升高，且当NaCl浓度达到80 mmol/L时，B0达到最高值。为了评价免疫孵育时间和酶催化时间对B0的影响，设置了不同免疫孵育时间(1575 min)和不同酶

18、催化时间(1060 min)作为反应条件，30 min是免疫孵育时间最佳条件(图3-d)，酶催化时间达到30 min后，B0进入平台期(图3-e)，因此最佳酶催化时间为30 min。a-pH；b-甲醇体积分数；c-NaCl浓度；d-免疫孵育时间；e-酶催化时间图3 Trypsin催化的FELISA检测条件优化Fig.3 Optimization of FELISA detection conditions catalyzed by Trypsin2.4 trypsin催化的FELISA检测性能评价以CIT浓度为横坐标，B0为横坐标绘制定量曲线(图4-a)，随着溶液中的CIT质量浓度从1.566

19、 400 ng/mL，B0逐渐增加，且在CIT质量浓度为12.5400 ng/mL时，B0随CIT浓度增加呈线性增加关系，其定量可用方程y=18.606 lnx-18.713(R2=0.992)，检测灵敏度IC20为8.01 ng/mL，IC50为40.16 ng/mL，为了与基于HRP-CIT的传统比色ELISA检测性能对比，设置腹水质量浓度为80、40、20、10 g/mL，HRP-CIT质量浓度为80、40、20、10 g/mL进行正交实验同样优化了二者浓度，结果如表2，根据竞争抑制率B0=(1-OD阴性/OD阳性)100(OD阴性为阴性条件下的吸光度，OD阳性为加标200 ng/mL条

20、件下的吸光度)，由最高竞争抑制率所对应的条件得出最佳腹水质量浓度为40 g/mL，HRP-CIT质量浓度为40 g/mL，同时基于此条件构建了基于HRP-CIT的传统比色ELISA，并绘制了其定量曲线(图4-b)，其定量可用方程y=13.476 lnx-11.975(R2=0.971 2)，检测灵敏度IC20为10.73 ng/mL，IC50为110.08 ng/mL，对比可得，本实验构建的FELISA检测灵敏度是传统比色ELISA的1.34倍，IC50是传统比色ELISA的2.741倍。a-trypsin催化的FELISA检测CIT定量曲线; b-HRP催化的比色ELISA检测CIT定量曲线

21、图4 Trypsin催化的FELISA与HRP催化的比色 ELISA检测性能比较Fig.4 Detection efficacy of FELISA catalyzed by trypsin and colorimetric ELISA catalyzed by HRP表2 棋盘滴定法优化包被腹水浓度和HRP-CIT浓度Table 2 Optimized coated ascites concentration and HRP-CIT concentration by a checkboard titration method注：*为最佳包被腹水浓度和HRP-CIT用本方法进一步检测质量浓度为

22、1 g/mL的常见真菌毒素CIT、脱氧雪腐镰刀菌烯酮(deoxynivalenone，DON)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、黄曲霉毒素B2(aflatoxin B2，AFB2)、黄曲霉毒素G1(aflatoxin AFG1，AFG1)和伏马毒素B1(fumonisin B1，FB1)，结果如图5所示，与常见真菌毒素无明显的交叉反应，表明本方法检测CIT具有较好的特异性。为了评价该方法检测实际样本的可行性，将不同质量浓度的CIT添加至玉米样本中，加标量分别为3.5、1.75、0.88、0.22 mg/kg，结果如表3，FELISA批内回收率分别为97.05%、98.97%、110.58%、90.94%，批间回收率分别为90.10%、109.11%、101.63%、93.46%，且批内、批间测定的标准偏差值均小于15%。检测结果与液相色谱串联质谱法作为参考方法进行对比，表4结果显示trypsin催化的FELISA检测结果与L