核酸及蛋白质的生物合成

1、核酸及蛋白质的生物合成第1页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四10.1 DNA的生物合成10.2 RNA的生物合成10.3 蛋白质的生物合成第2页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四 生物亲代与子代之间，在形态、结构和生理功能上常常相似，这就是遗传现象。 生物的遗传特性，使生物界的物种能够保持相对稳定。 根据现代细胞学和遗传学的研究得知，控制生物性状的主要遗传物质是脱氧核糖核酸（DNA）。金丝猴的后代仍然是金丝猴牛的后代仍然是牛生物的各项生命活动都有它的物质基础。生物遗传的物质基础是什么呢？第3页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四

2、 DNA是生物遗传的主要物质。生物机体的遗传信息以密码的形式编码再DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息自DNA转录给RNA，然后翻译成特异的蛋白质（中心法则）。以执行各种生命功能，使后代表现相似的遗传性状。中心法则 (Crick,1958) 第4页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四转录在DNA分子上合成出与其核苷酸顺序相对应的RNA的过程。复制遗传物质从亲代DNA传递到子代DNA分子上，合成出与原来DNA相同分子的过程。翻译在RNA的指导下，根据核酸链上每三个核苷酸决定一个氨基酸的三联体密码规则，合

3、成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链的过程。Reverse transcription第5页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四10.1 DNA的生物合成 复制过程可分为：起始、延长和终止3个阶段。一、DNA的半保留复制 通过碱基配对(A-T,C-G),两条链连在一起，成为互补链。一条链上核苷酸排列顺序决定了另一条链上的核苷酸排列顺序，每一条链都含有合成它的互补链所必需的全部遗传信息。第6页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四 DNA复制过程中，首先碱基间氢键断裂并使双链解旋和分开，然后每条链可作为模板在其上合成新的互补连，新形成的两个DNA分子与原来DN

4、A分子的碱基顺序完全一样。在此过程中，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链子是新合成的。这种方式称为半保留复制。 第7页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四第8页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四DNA复制第9页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四（一）半保留复制的实验依据 1958年，Messelson 和 Stahl用实验加以证实。细菌可利用NH4Cl作氮源合成DNA。 普通DNA的沉降位置含15N-DNA 的细菌第一代第二代培养于含14N-DNA的普通培养液重DNA的沉降位置细菌的DNA双链含15N-DNA链含14N-

5、DNA链密度梯度离心结果普通DNA的沉降位置第10页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四 实验结果表明:子一代DNA双链中有一股是15N单链，而另一股是14N单链，前者是从亲代接受和保留下来的，后者则是完全新合成的。（二）半保留复制的意义半保留复制的意义： 按半保留复制的方式，子代保留了亲代的全部遗传信息，体现在亲代与子代之间DNA碱基序列的一致性上。体现了遗传过程的相对保守性（不是绝对的）。是物种稳定的分子基础。A TG CA TA TC GA TG CA TA TC GA TG CA TA TC G亲链子链子链亲链第11页，共167页，2022年，5月20日，23点7分

6、，星期四二、DNA复制的起点和方式 复制子基因组能独立进行复制的单位。 每个复制子都含有控制复制起始的起点（富含A、T区），可能还有终止复制的终点。复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制开始，它既继续下去，直到整个复制子完成复制。J.Cairns（1963年）第12页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四 Direction of DNA replication 原核生物的染色体和质粒，真核生物的细胞器DNA都是环状的双链分子，都在一个固定的起点 开始复制，复制的方向是双向的。即形成2个复制叉。第13页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四复制叉亲代链分开及新

7、生DNA开始复制处形成的Y形结构。细菌DNA复制叉移动的 速度大约50000bp/min，真核生物 染色体DNA复制叉移动的 速度大约10003000bp/min，高等真核生物一般复制子为100200kb。第14页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四DNA新起始方式（de novo initiation）复制的基本模式Parental D.S,DNAUnwinding proteinRNA polymerase Primase DNA polymerase leading Strand lagging StrandElongation of lag.& lea. stran

8、ds DNA polymerase Poly(dNt) ligase Replication loop RNA primerRNA-primed DNA pieces (1kb)Continuous 5 to 3 in Leading S.Discontinuous 3 to 5 in lagging S.Two long DNA piecesMany shorter DNA pieces (1-2 kb) Repair & filling in 5 to 3Bidirectional lengthening of new stands眼形结构第15页，共167页，2022年，5月20日，23

9、点7分，星期四三、原核生物DNA复制的酶学DNA复制所需的物质及作用1、底物：dNDP 。2、聚合酶：依赖DNA的DNA聚合酶，简称DNA-pol。3、模板：解开成单链的DNA母链。4、引物：提供3-OH末端，使dNDP可以依次聚合。5、其他酶和蛋白因子（如：引物酶、解旋酶、DNA连接酶、拓扑异构酶、单链DNA结合蛋白等）。第16页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四（一）复制中解链和DNA分子拓扑学变化拓扑物体或图像做弹性位移而又保持物体不变的性质。核酸的拓扑结构核酸分子结构的空间关系。共同起解开、理顺DNA链，维持DNA在一定时间内处于单链状态的作用。解螺旋酶（DNA

10、helicase) 解开双链。同样功能的还有Rep蛋白。 DNA拓扑异构酶（Top I 、Top II）改变DNA分子拓 扑构象。 单链DNA结合酶 （SSB) 维持模板的单链状态并保持单链的完整。解旋、解链酶Top ICut D.S. DNAATPLigateTop IITop I在DNA的一股链上产生缺口，使另一条链得以穿越。Top II则在DNA的双链上产生缺口，使另一双链DNA片段得以穿越。第17页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四（二）引物酶（Primase)和引发体(Primosome) 引物酶(Dna G )：催化引物合成的一种RNA聚合酶。 引物酶在模板的

11、复制起始部位催化互补碱基的聚合，形成短片断的RNA。引物酶和解螺旋酶共同起作用。 引发体： Dna A 蛋白、 Dna B蛋白 、Dna G 蛋白、 Dna C及其他复制因子，一起形成复合体，结合引物酶，形成较大的聚合体，再结合到模板DNA上。 引发体的下游解开双链，再由引物酶催化引物的合成。解螺旋辨认起点引物酶第18页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四Primosome （consists of six proteins） PriA (dual role) displace SSB from S.S DNA and helicase DnaT required at p

12、repriming stage DnaB is central component, action with DnaC DnaC is central component, action with DnaB PriB function is unknown PriC function is unknown DnaG primase第19页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四（三）DNA聚合反应和聚合酶1、DNA聚合反应 Kornberg(1956)发现了DNA聚合酶。该酶可催化4种脱氧核糖核苷三磷酸合成DNA。脱氧核糖核苷酸被加到DNA链的末端，同时释放出无机焦磷酸。（dN

13、MP)n + dNTP (dNMP)n+1 + ppi DNA 延长了的DNA 第20页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四 反应需要接受模板的指导 引物：反应需要有引物3羟基存在。 底物：4种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP） 产物DNA的性质与模板相同。 复制在5-3方向延伸DNA聚合酶的反应特点:第21页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四2、DNA聚合酶(DNA pol)DNA聚合酶(pol-,Konberg)：由一条单一多肽链组成 ，分子形状呈球体。当有底物和模板存在时，可使脱氧核糖核苷酸逐个加到具有3-OH末端的多核苷酸链上。和其他的DNA聚合酶

14、一样，只能延长多核苷酸链，即要有引物的存在。而不能从无到有开始DNA链的合成。 可催化的反应：A:核苷酸聚合反应，使DNA链延5 3方向延长（聚合酶活性填补缺口）。B:由3端水解DNA 。（3 5核酸外切酶活性校正错误）。C:由5端水解DNA 。（5 3核酸外切酶活性切除引物）。D:由3端使DNA链发生焦磷酸解。E:无机焦磷酸盐与脱氧核糖核苷三磷酸之间的焦磷酸基交换。 每个大肠杆菌细胞约有400个分子的DNA聚合酶。 DNA聚合酶不是复制酶，而是修复酶，起着去除RNA引物的作用，只是参与局部修复。（ DNA聚合酶 、）第22页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四（2）DNA

15、聚合酶（ pol- ）, DNA聚合酶 为多亚基酶。作用：A:从5 3方向合成DNA，并需要带有缺口的双链DNA作为模板，缺口不能过大。B: 3 5核酸外切酶活性，但无5 3 核酸外切酶活性。 不是复制酶，而是修复酶。 每分子每分钟催化2400个dNTP的聚合。 每个大肠杆菌细胞约有100个分子DNA聚合酶 。第23页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四（3）DNA聚合酶（pol- ）DNA聚合酶为多亚基（10种）组成的蛋白质，其全酶由、10种亚基组成。是DNA的复制酶。 每个大肠杆菌细胞约有10-20个分子DNA聚合酶。 作用：其性能与DNA聚合酶相似。A:需要模板，以d

16、NTP为底物，需要有引物的存在，从5 3方向合成DNA。B:具有3 5核酸外切酶活性，但无5 3核酸外切酶活性。C：多亚基酶。第24页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四pol- 异二聚体结构核心酶DNA聚合酶全酶亚基组成亚基亚基数亚基功能2聚合活性。催化从5 3方向合成DNA。235外切酶活性，校对功能 核心酶2组建核心酶2核心酶二聚化2依赖DNA的ATP酶，形成复合物1可与亚基结合，形成复合物1形成复合物1形成复合物1形成复合物4两个亚基形成滑动夹子，以提高酶的持续合成能力。夹子装配器第25页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四pol- 异二聚体结构

17、第26页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四亚基由两个形成夹子结构第27页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四（4）DNA聚合酶和DNA聚合酶 涉及DNA的错误倾向修复。使修复缺乏准确率。 DNA受到较严重的损伤时，即可诱导产生这两种酶。第28页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四 DNA聚合酶 酶作 用DNA聚合酶不能从无到有开始DNA合成，要有引物链。5 3聚合酶及外切酶作用，3 5外切酶酶作用，可校正/修复DNA链，还可切除引物。DNA聚合酶5 3聚合酶及3 5外切酶酶作用，可校正/修复DNA链。DNA聚合酶与酶作用类似，酶活高

18、，是主要的链延伸酶（聚合酶 replicase）。DNA聚合酶涉及DNA的错误倾向修复。DNA受到严重损伤时，可诱导产生，使修复缺乏准确性。DNA聚合酶同上。第29页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四第30页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四第31页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四（四）DNA连接酶DNA聚合酶只能催化DNA链的延长反应，不能使链之间连接。DNA连接酶催化双链DNA切口处的5磷酸基和3羟基生成磷酸二 酯键。 DNA连接酶在DNA的复制、修复和重组等过程均起重要的作用。反应分三步进行：第一步：NAD或ATP+DN

19、A连接酶 酶-AMP复合物第二步：酶将AMP转移给DNA切口处的5磷酸，形成AMP-DNA。 第三步：通过相邻链的3-OH对活化的磷原子发生亲核攻击， 生成3 ，5磷酸二酯键。同时释放出AMP。Nick：指断裂的磷酸二酯键。Gap：指缺失核苷酸第32页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四四、原核生物DNA生物合成过程Top I , Top II Helicase (rep protein) Single Strand Binding protein (SSB)Helix destabilizing protein (HDP)DnaB priteinDnaC protein

20、Primase Ung-ase DNA Polymerase III DNA Polymerase I Ligasefor primosome复制体进化中形成了活的多酶复合体 replisome第33页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四包括起始、延伸和终止三个阶段。1、起始阶段 复制的起始阶段主要是引发体的形成。(1)Dna A蛋白识别并结合于起始点ori C。(2)Dna 、Pri A、引物酶等相继结合，组成复制引发体。（3）拓扑异构酶引入负超螺旋，促进Dna A的结合，同时消除扭曲张力。（）聚合酶结合到模板上，在引物的后面合成新的链。解螺旋水解ATP推动DNA解链合成

21、引物第34页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四半不连续复制：在复制叉上前导链连续合成子代链，而滞后链不连续合成子代链。2、延伸阶段前导链以走向3 5的亲代链为模板，连续合成子代链。滞后链以走向5 3的亲代链为模板，不连续合成子代链。冈崎片断滞后链侧的较小的DNA片断。 每一个复制叉上只有一个DNA聚合酶全酶的二聚体。同时在前导链和滞后链上完成复制任务。第35页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四（滞后链）（前导链）DNA生物合成过程单链DNA结合蛋白（DNA聚合酶）（DNA聚合酶）第36页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四DNA生

22、物合成过程（DNA聚合酶）(DNA引物酶)（冈崎片断)（RNA引物）（解螺旋酶）（DNA聚合酶）（滞后模板）复制叉上蛋白质的协作（前导模板）第37页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四两个复制叉在ori C 约180度的对面相遇，在这一区域有几个终止子的位点，它们与tus基因产物即Dna 解旋酶的抑制剂结合，从而阻止复制叉的前进。复制终止后，由DNA聚合酶填补空隙，最后由连接酶封口。3、复制的终止第38页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四DNA复制的要点是：1）在复制开始阶段，DNA的双螺旋拆分成两条单链。第39页，共167页，2022年，5月20日，

23、23点7分，星期四2）以DNA单链为模板，按照碱基互补配对的原则, 在DNA聚合酶催化下，合成与模板DNA完全互补的新链，并形成一个新的DNA分子。第40页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四3) 通过DNA复制形成的新DNA分子, 与原来的DNA分子完全相同。 经过一个 复制周期后，子代DNA分子的两条链中，一条来自亲代DNA分子，另一条是新合成的，所以又称为半保留复制。第41页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四五、真核生物DNA的复制合成真核DNA的合成的基本过程类似于原核DNA，不同之处： 复制速度慢，多复制起点。 全部复制完之前起点不再重新开始

24、复制。 至少有五种聚合酶。DNA聚合酶（）DNA聚合酶（）DNA聚合酶（M)DNA聚合酶（）DNA聚合酶 （）亚基数41221分子量（KD)25036-38160-300170256细胞内定位核核线粒体核核引物合成酶活性35外切活性+功能引物合成修复线粒体DNA合成核DNA合成修复第42页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四第43页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四端粒的复制依赖于端粒酶。端粒-每一线性DNA末端含有多拷贝的富含G的六核苷酸重复序列。 真核生物染色体 DNA末端补齐模式 端粒的发现 1938 Muller X-ray 四膜虫Drosop

25、hila 末端极少发生缺失和倒位推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定.并定名为Telomere 1938 B.McClintock 顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。 推测染色体末端具有特殊端粒结构。1970s 分子生物学发展 端粒研究获得突破第44页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四 端粒DNA (Telomer) TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 3 (rich G chain) 3 AACCCC AACCCC AACCCC 5 (rich C chain) 1985. Carol G

26、reider & Blackburn, 1986. Gottchling 尖毛虫 telomere binding protein 1 55kd telomere binding protein 2 26 kd四膜虫 telomerase 将T2G4 末端重复延伸 游扑虫 Telomerase = RNA CAAAACCCC 链 + 末端结合蛋白 （TBP） + 100 bp telomere第45页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四 长 短细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂端粒阈值端粒长短端粒酶活 Harley (1989)端粒的重复片段为探针检测 胎儿细胞株婴儿细胞

27、株青年细胞株老年细胞株年龄小 大端粒长度早老性侏儒症的端粒明显较正常人短“多莉”的衰老研究端粒（记时器）丢失的速率/ 年，预测人类的寿命 XX XY why?PCD机制、癌细胞的无限繁殖第46页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四六、DNA的损伤及其修复 DNA的损伤形式包括：碱基修饰、碱基改变、核苷酸删除和插入、DNA链的交联、磷酸二酯键骨架的断裂。 损伤可造成突变或致死 。 许多DNA损伤可修复。 只有逃过修复的损伤才会造成突变。 突变（mutation）：指一种遗传状态，可以通过复制而遗传的DNA结构的任何永久性改变。 携带突变基因的生物称为突变体。 未突变的称为野生

28、型。DNA是细胞内唯一可以修复的大分子。第47页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四（一）诱发突变的原因物理（紫外、高能射线、电离辐射）化学（烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物）生物因素（碱基对置换、碱基的插入/ 缺失造成移码）第48页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四光聚合反应 胸腺嘧啶碱基在紫外光照射下，可以发生二聚加成反应： 在DNA分子中，如果两个胸腺嘧啶碱基相邻，在紫外光照射下，可能发生上述聚合反应，其结果是破坏了正常复制或转录。物理因素第49页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四当DNA受到大剂量紫外线（波长260nm附近

29、）照射时，可引起DNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如嘧啶二聚体（TT二聚体）。第50页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四 化学因素化学因素是引起DNA结构发生变化的最常见因素，主要包括：烷基化试剂，亚硝酸盐以及碱基类似物等。烷基化试剂能够与DNA分子中的氨基或氧作用，生成烷基化DNA。除了碱基上有多个位置可被烷基化外，DNA链上磷酸二酯键中的氧也容易被烷基化，从而导致DNA链的断裂。第51页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四烷基化反应由于含氧碱基存在酮式和烯醇式的互变异构，烯醇式中的羟基可以被烷基化转变为稳定的烯醇醚。鸟嘌呤核苷烷基

30、化形成6-甲氧基鸟嘌呤核苷后，不再与C配对，而与T配对。这种情况将引起DNA的复制、转录及信息表达出现错误。第52页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四环外氨基的反应 环外氨基在适当条件下，也可以发生化学反应。胞嘧啶核苷在亚硝酸作用下，可以形成重氮盐，再转变为尿嘧啶核苷。因此生物体内亚硝酸的存在有可能改变DNA的碱基组成。腺嘌呤核苷和鸟嘌呤核苷也能发生类似的反应，分别形成次黄嘌呤核苷（I）和黄嘌呤核苷（X）。这种变化，将影响或改变碱基形成氢键的能力和方向，导致DNA复制错误，是引起基因突变的重要原因之一。第53页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四碱基类

31、似物是一类结构与核酸碱基相似的人工合成或天然化合物，由于它们的结构与核酸的碱基相似，当这些物质进入细胞后能够掺入到DNA链中，干扰DNA的正常复制和转录。常见的有碱基衍生物及稠环、稠杂环类化合物。例如5-溴尿嘧啶（5-BU），它与胸腺嘧啶碱基的结构相似，能取代T与A配对。又如一种称为二恶英的含氯芳香杂三环化合物（2,3,7,8-四氯-二苯-二恶英，简称TCDD），是一种具有强烈致癌和致畸物质。它能够进入细胞并与DNA结合，导致DNA复制发生错误，从而可能诱发癌变。第54页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四（二）突变分子改变的类型措配、缺失、插入、重排。碱基顺序颠倒，如TA

32、被颠倒成AT第55页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四某个碱基被调换，如AT换成GC（二）突变分子改变的类型第56页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四胞嘧啶核苷在亚硝酸作用下，可以形成重氮盐，再转变为尿嘧啶核苷。因此生物体内亚硝酸的存在有可能改变DNA的碱基组成。（二）突变分子改变的类型第57页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四少了或多了一对或几对碱基，例如：5 ATGGCTATGC 3 变成 5 ATGGTATGC 3 3 TACCGATACG 5 3 TACCATACG 5（二）突变分子改变的类型第58页，共167页，202

33、2年，5月20日，23点7分，星期四遗传变异的化学本质DNA结构的改变将导致相应蛋白质一级结构（氨基酸顺序）的变化，从而引起生物特征或性状发生变异。所以，一切生物的变异和进化都可以认为是由于DNA结构的改变而引起蛋白质组成和性质变化的结果。第59页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四（三）DNA损伤的修复DNA修复指针对已发生了的缺陷而实行的补救机制，主要有光修复、切除修复、重组修复和SOS修复。1、光修复（photoreactivation）可见光（最有效波长400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。是一种高度专一的修复形式，只分解

34、由于UV照射而形成的嘧啶二聚体。光修复酶第60页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四第61页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四2、切除修复（excision repair）是细胞内最重要的修复机制在一系列酶（DNA聚合酶、连接酶、解旋酶）的作用下，将DNA分子中受损伤的部分切除掉，并以完整的那一段为模板，合成出切去的部分，从而使DNA恢复正常。这是一种比较普遍的修复机制。细胞的修复功能对于保护遗传物质DNA不受破坏有重要意义。第62页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四3、重组修复（recombination repair）又称复制

35、后修复（postreplication repair）受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重复修复。并非完全校正。第63页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四4、SOS修复 指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，又称倾错性修复（Error-Prone Repair ）。第64页，共167页，2022年，5月20日，2

36、3点7分，星期四基因重组与DNA克隆（基因工程）限制性内切酶 能识别DNA特定核苷酸序列的核酸内切酶分布：主要在微生物中。特点：特异性，即识别特定核苷酸序列， 切割特定切点。结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。第65页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有400500多种。第66页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四运载体种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。质粒的特点:细胞染色体外能自主复 制的

37、小型环状 DNA分子；质粒是基因工程中最常用的运载体；最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；存在于许多细菌及酵母菌等生物中；质粒的存在对宿主细胞无影响；质粒的复制只能在宿主细胞内完成。第67页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四 DNA重组与克隆从细胞中分离出DNA限制酶截取DNA片断分离大肠杆菌中的质粒 DNA重组用重组质粒转化大肠杆菌培养大肠杆菌克隆大量基因重组体的筛选第68页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四PCR(polymerase Chain reaction)聚合酶链式反应PCR也称体外酶促基因扩增，原理类似天然DNA复制。靶DNA分子变性后解链

38、，两条单链DNA分别与两条引物互补结合，在4种dNTP存在和合适和条件下，由耐热的Taq DNA聚合酶催化引物由5 3 扩增延伸，形成两条新的双链DNA分子，并作为下一循环的模板。每经过一个变性、复性、延伸循环，模板DNA增加一倍。经过3050个循环，可使原DNA量增加106109倍。PCR的主要步骤： 模板DNA的变性 一般选用95左右1min，使DNA 双链解为单链 复性 按引物实际情况确定适当温度，时间一般30s至1.5min 延伸 一般72 1min 循环数 按初始模板浓度确定，一般2545之间第69页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四第70页，共167页，202

39、2年，5月20日，23点7分，星期四PCR的引物设计 PCR扩增产物的特异性主要由引物决定，引物的设计是PCR成功的关键， 引物位置和产物长度 根据不同目的和要求确定，长度一般在200800bp之间 引物的长度 一般为1825bp 末端核苷酸 3端不得有任何修饰 GC含量和Tm值 一般在4060%之间，两条相差23 第71页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四10.2 RNA的生物合成 DNA携带的遗传信息传递给RNA分子的过程称转录（transcription ）。 在生物界，RNA合成有两种方式：一是DNA指导的RNA合成，此为生物体内的主要合成方式。另一种是RNA指导

40、的RNA合成，此种方式常见于病毒。转录产生的初级转录本是RNA前体（RNA precursor），需经加工过程（processing）方具有生物学活性。 第72页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四一、原核生物中的基因转录第73页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四第74页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四合成方向： 53从头合成。连接方式： 3 , 5磷酸二酯键。 5-末端的起始核苷酸常为GTP或ATP。合成过程:连续转录特点：不对称转录-DNA片段转录时，双链DNA中只有一条链作为转录的模板，这种转录方式称作不对称转录。模板链(

41、template strand)及反义链(antisense strand):指导RNA合成的DNA链为模板链，又称反义链。编码链(coding strand)及有义链(sense strand)：不作为转录的另一条DNA链为编码链，又称有义链。由于基因分布于不同的DNA单链中，即某条DNA单链对某个基因是模板链，而对另一个基因则是编码链。原料：四种三磷酸核苷NTP,DNA中的T在RNA合成中变为U。转录基本特点第75页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四第76页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四第77页，共167页，2022年，5月20日，23点7分

42、，星期四调节基因启动子操纵基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP复合物mRNA+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰基转移酶酶 “转录单位”（transcriptionunit）：以操纵子（operon）为转录的功能单位,结构上包括四个功能区：多顺反子（结构基因区）、启动子、操作子、终止子和调节基因。第78页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四识别解链起始延伸终止终止位点起始位点第79页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四 大肠杆菌的RNA聚合酶 全酶由5种亚基2 组成。因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易于与2分离。 没有亚

43、基的酶称为核心酶只催化链的延长，对起始无作用。 只有全酶能够找到转录的起始位点并起始。 五种亚基的功能分别为： 亚基：与启动子结合功能，决定转录的基因类型。 亚基：含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸二酯键，参与转录的全过程。 亚基：在全酶中存在，功能不清楚。 亚基：与DNA模板结合功能。参与转录的全过程。 亚基：识别起始位点，转录延长时脱落。 1. 启动子和起始第80页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四第81页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四第82页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四 启动子是基因起始处的DNA序列。 识别正

44、确的启动位点，启动子的结构至少由三部分组成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶识别的信号；-10序列是酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）；第三部分是RNA合成的起始点。 解旋从RNA聚合酶结合的启动子部位开始，然后从起始位点的核苷酸处起始RNA链的合成。第一位点被定义为基因序列的+1位置。53+1转录起始点AACTGTATATTATTGACATATAAT5335序列 Sextama 框 10序列Pribnow框+1对解旋很重要最保守第83页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四2. 转录起始 加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP。所形成的启动子、全酶和核苷三磷酸

45、复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点， 亚基就会被释放脱离核心酶。-35-10pppG 或 pppA5533模板链E第84页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四3.链的延伸 以NTP为原料和能量,DNA模板链为模板，靠核心酶的催化，核苷酸间通过3,5-磷酸二酯键成核糖核酸链(RNA)。转录的第一个核苷酸总是pppG或pppA。第85页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四4. 转录终止 转录终止在特殊的终止子序列。转录终止信号分两类：一类是不依赖因子(即蛋白)，另一类是依赖因子。 不依赖于因子的这一类，其DNA链的3 端附近有富含

46、GC的回文区域和随后的一段富含AT的序列。当以这段终止信号为模板转录出的RNA即形成具有茎环的发夹形结构(hairpin structure)，其3 端含有一串UUUU的尾巴（图8.40），这种发夹结构阻碍了聚合酶的进一步延伸，RNA链的合成即终止。 第86页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四 另一类依赖因子的终止，其DNA链的3端附近的回文序列没有富含G-C碱基的区域，后面也没有连续的A存在，需因子的参与才能完成链的终止。因子是由基因编码的相对分子质量为55 000的蛋白质。现在一般认为因子是与正在合成的RNA链相结合，并利用水解ATP或其他核苷三磷酸释出的能量从5 -

47、3 端移动，当聚合酶遇到终止信号时，聚合酶移动速度减慢，因子就很快追赶上来，使转录终止，释放RNA，并使RNA聚合酶与因子一起从DNA上脱落下来。 第87页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四二、真核生物的转录作用酶类分布产 物活性分子量(KDa)反应条件核仁rRNA（5.8S、18S、28S ）5070500低离子强度要求Mg2+或Mn2+核质mRNA、snRNA2040700高离子强度核质tRNA、5SrRNA、snRNA、7sRNA10700高Mn2+浓度1.真核RNA聚合酶2. 转录 真核RNA转录基本过程与原核类似，但其产生的mRNA为“单顺反子”，只编码一条肽链

48、。第88页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四转录产物的“加工”（成熟过程） 在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物（primary transcript）往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5和3末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或称为RNA的转录后加工。 原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。rRNA前体的转录后加工tRNA前体的加工真核mRNA前体的加工 第89页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四rRNA前体的加工rRNA基因之间以

49、纵向串联的方式重复排列。加工过程： 1、剪切作用：需核酸酶参与。 2、甲基化修饰：修饰在碱基上。 3、自我剪接：一种核酶的作用。原核rRNA加工：rRNA含非转录的间隔区，其产物中含tRNA 真核rRNA加工： 1.5S自成体系加工少无修饰和剪接。2.45S加工中含剪切和甲基化修饰，需核酸酶。第90页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四tRNA前体的加工tRNA前体在tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的tRNA分子 3末端加上CCA碱基的修饰：甲基化、脱氨和还原作用第91页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四第92页，共167页，2022年，5月20日

50、，23点7分，星期四 真核mRNA前体的加工剪接（Splicing） 去除内含子，连接外显子5帽端结构的生成（ 5 端加7-甲基化鸟苷，防止外切酶的 攻击）3端多聚A（polyA）的附加第93页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四第94页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四RNA的复制合成（RNA指导的RNA合成）噬菌体Q的RNA复制两阶段（1）其单链RNA可充当mRNA，利用寄主中的核糖体合成外壳蛋白和RNA复制酶的亚基。（2）复制酶的亚基可与来自寄主细胞的亚基自动装配成RNA复制酶，可进行RNA的复制，以分子中单链RNA为模板（正链），复制出一条新的

51、RNA链（负链），再复制出正链，与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。某些RNA病毒可以以自身RNA为模板进行复制。不同的RNA病毒复制方式不同5 RNA-5 3 3 RNA+释放释放35 3 3 5 5 RNA+RNA+RNA-RNA-及 RNA+的合成方向均为5 3第95页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四核酶 1982年Cech发现四膜虫rRNA前体自我剪接作用，RNA有催化作用;1983年发现RNase P中的RNA可催化tRNA前体的加工。核酶自我切割区内有锤头结构（hammer-head structure），其中的结构特点是：（1）三个茎区形成局部的双链结构；其中

52、含13个保守的核苷酸，N代表任何核苷酸。（2）图中的箭头表示自我切割位点，位于GUX的X外侧，X可表示为C、U或A，不能是G。 核酶的生物学意义 1.RNA为生物催化剂，具有重要生物学意义。2.打破了酶是蛋白质的传统观念。3.在生命起源问题上，为先有核酸提供了依据。4.为治疗破坏有害基因，肿瘤等疾病提供手段。第96页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四基因表达转录调控方式基因表达调控概述原核生物以操纵子为单元进行表达和调控，特异的阻遏蛋白是控制原核启动序列活性的重要因素。 乳糖操纵子的调节机制色氨酸操纵子的调节机制第97页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星

53、期四I调节基因P启动子O操作子（操作基因）Z、Y、A三种结构基因第98页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四阻遏蛋白的负性调节 当无诱导物乳糖存在时，调节基因编码的阻遏蛋白（repressor protein）处于活性状态，阻止RNA聚合酶与启动基因的结合，则无法启动转录。 当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。乳糖进入细胞，经半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、转录发生。 异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。 CAP（代谢产物活化

54、蛋白）的正性调节 当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CAP结合，这时CAP结合在lac启动序列附近的CAP位点，可刺激RNA转录活性。葡萄糖的分解代谢产物能抑制腺苷酸环化酶活性并活化磷酸二酯酶，从而降低了cAMP的浓度，CAP不能被活化形成CAPcAMP复合物，则不能转录。第99页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四lac阻遏蛋白负性调节与CAP正性调节两种机制协调合作：当Lac阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；但是如果没有CAP存在来加强转录活性，即使阻遏蛋白从操纵序列上解聚仍几无转录活性。 lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖存在又需缺乏葡萄糖。

55、第100页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四10.3 蛋白质的生物合成Reverse transcription遗传信息第101页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四基因的遗传信息在转录过程中从DNA转移到mRNA，再由mRNA将这种遗传信息表达为蛋白质中氨基酸顺序的过程叫做翻译。合成体系：20种氨基酸,mRNA、tRNA、核蛋白体、酶和因子,以及无机离子、ATP 、GTP 合成方向：NC端。 翻译过程分为：起始、延长、终止3个阶段。真核细胞第102页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四一、遗传密码密码子（Codon）或三联体密码为

56、一个氨基酸编码进入蛋白质多肽链特定线性位置的三个核苷酸单位。遗传密码规定着多肽链氨基酸序列的mRNA 上核苷酸序列。（一）遗传密码是三联体密码起始密码子：AUG，编码甲硫氨酸。终止密码子：UAG、UGA、UAA，不编码氨基酸。第103页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四密码子的发现 统计学方法人工合成仅由一种核苷酸组成的多聚核苷酸，推测由哪一种氨基酸合成的多肽核糖体结合试验 1965年，Nirenberg用poly u加入C14标记的20种aa,仅有苯丙氨酸的寡肽,UUU=苯丙氨酸,用此法破译了全部密码，编出遗传密码表。第104页，共167页，2022年，5月20日，23

57、点7分，星期四（二）遗传密码子的特点：1、无标点、不重叠 每个三联体中的三个核苷酸只编码一个氨基酸。2、简并(degeneracy) 和摆动 43=64种密码子决定20种氨基酸。几种密码子对应于同一种氨基酸。这些密码子为同义密码子。密码子的第三个位置称为摆动位置。3、普遍性 绝大多数密码子对各种生物都适用，某些线粒体中遗传密码有例外。4、终止密码子 UAG、UAA、UGA。5、起始密码子 AUG（真核中起始为Met、原核中起始为fMet,翻译中间为Met）。第105页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四6、阅读框架阅读框架1 53阅读框架2 5U U A U G A G C

58、 G C U A A A ULeu 终止 Ala Leu AsnU U A U G A G C G C U A A A U Tyr Glu Arg 终止U U A U G A G C G C U A A A U Met Ser Ala Lys3阅读框架3 533种可能的阅读框架起始密码子第106页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四遗传密码第107页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四 以mRNA为模板，氨基酸经活化获得的氨酰tRNA为原料，GTP、ATP供能，在核糖体中完成。3个阶段：起始、延长、终止。（二）氨酰tRNA的合成 tRNA在氨基酰-tRN

59、A 合成酶的帮助下，能够识别相应的氨基酸，并通过tRNA氨基酸臂的 3-OH 与氨基酸的羧基形成活化酯氨基酰-tRNA。 氨基酰-tRNA的形成是一个两步反应过程：第一步是氨基酸与 ATP 作用, 形成氨基酰腺嘌呤核苷酸； 第二步是氨基酰基转移到 tRNA 的 3-OH 端上, 形成氨基酰-tRNA。二、蛋白质合成-翻译（一）概述第108页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四氨基酸活化图示第109页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四氨基酸活化的总反应式是： 氨基酰-tRNA 合成酶氨基酸 + ATP + tRNA + H2O 氨基酰-tRNA + AM

60、P + PPi每一种氨基酸至少有一种对应的氨基酰-tRNA 合成酶。它既催化氨基酸与 ATP 的作用, 也催化氨基酰基转移到 tRNA。氨基酰-tRNA 合成酶具有高度的专一性。 每一种氨基酰-tRNA 合成酶只能识别一种相应的 tRNA。 tRNA 分子能接受相应的氨基酸, 决定于它特有的碱基顺序, 而这种碱基顺序能够被氨基酰-tRNA 合成酶所识别。第110页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四氨基酸的活化第111页，共167页，2022年，5月20日，23点7分，星期四（三）参与蛋白质合成的三类RNA及核糖体1.rRNA 与蛋白质一起构成核糖体蛋白质合成“工厂” 核糖