肝癌干细胞差异表达miRNA的筛选及鉴定

1、肝癌干细胞差异表达 miRNA的筛选及鉴定Screen and identification of differentially expressed miRNAs in liver cancer stem cells and oval cells ZHOU Guang-jun ，SHI Kun，ZHAWen-zhang，MUXiang-ming. The Fist Peoples Hospital of Yancheng City, Yancheng 224000,China【】 Objective To determine differentially expressed miRNAs of

2、 liver cancer stem cells and oval cells.Methods Liver cancer stem cells and oval cells were isolated from the livers of human cancer patients. The difference in miRNAsexpression between liver cancer stem cells and oval cells was detected by both microarrays and Northern blot.Results Forteen miRNAsin

3、 liver cancer stem cells were expressed 1.5 fold above the levels in oval cells, three miRNAs in liver cancer stem cells were expressed 1.5 fold below the levels in oval cells. The expression of six selected miRNAswas further validated by Northern blot and three were confirmed.Conclusion The express

4、ion of a number of miRNAs in liver cancer stem cells and oval cells may suggest the potential roles of these miRNAs and applicability as diagnostic and prognostic signatures in liver cancer.肿瘤干细胞( tumor stem cells,TSC )是近年来实体肿瘤 研究的热点， 对实体瘤认识产生了重大影响。 肝癌、脑恶性肿瘤、 乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤中都发现了TSC并且其表面标记特征与生长特征等也得到一

5、定阐述1。TSC具备高度增殖能 力与自我更新能力， 也具备多向分化的潜能， 是一种特殊类型的 干细胞。TSC通过不均一分裂，一个TSC分裂形成一个新的TSC 和另一个可最终分化为包括肿瘤细胞在内的各种细胞的子细胞， 其结果是维持TSC数目稳定并产生肿瘤。TSC的特性包括极强的 致瘤能力与自我更新并多向分化， 并且有高耐药的特征。 目前认 为，TSC来源于正常成体干细胞1 o肝癌是TSC研究的热点之一。肝癌也越来越被设想为一种干 细胞疾病。近年来，本课题组人员从大鼠肝癌中分离、培养并纯 化出一些有干细胞特性的细胞， 有强的致瘤能力，与TSC比较接 近，并且对这些细胞的增殖能力，转移能力，细胞生长

6、特征，细 胞周期分析等生物学特征也进行了初步的研究24o人们称肝癌中的TSC为肝癌干细胞。随着miRNA研究的进展，人们发现某些miRNA在干细胞的自 我更新的维持和哺乳动物早期发育起关键作用5。本文采用miRNAs芯片技术和Northern印迹，筛选并鉴定肝癌干细胞中差 异表达miRNA可望为肝癌的基因治疗提供全新的靶标和策略，为肝癌的发病机制和诊断治疗研究提供了新的思路。1 材料与方法1.1材料MEM培养基购自Hyclone ,胰酶购自Sigma,胎牛 血清为杭州四季青公司产品， 琼脂糖购自北京邦定生物公司， 甲 醛购自北京化工厂，美国台盼蓝染液购自华美生物工程 XX公司， OV6 CKI

7、9、自蛋白和甲胎蛋白抗体来自武汉博士德公司。硝酸 纤维素膜购自 Millipore 公司。实验方法和步骤1.2.1 肝癌手术标本选取 取 3例肝癌患者手术后标本进行 实验。卵圆细胞培养、 分离与鉴定 取标本中肝脏正常组织，组织块法分离、培养大鼠卵圆细胞。鉴定方法：（1）测定细胞的大小及形态学观察；（ 2）免疫细胞荧光鉴定，抗体包括 OV6、 CKI9、自蛋白和甲胎蛋白等。肝癌干细胞样细胞培养、分离与鉴定 取处于对数生 长期的肝癌细胞，有限稀释法单克隆分离、培养肝癌干细胞；裸 鼠成瘤实验验证其成瘤能力后， 观察高成瘤能力， 有分化能力的 肿瘤细胞即为肝癌干细胞样细胞。测量肝癌干细胞及卵圆细胞 m

8、icroRNA 表达谱并进行验证 取上面培养中的肝癌干细胞及卵圆细胞，利用microRNA芯片比较两种细胞表达microRNA差异情况。microRNA芯片采用博 奥生物XX公司的产品，该芯片含人类 238个microRNA,包括目 前已经研究成熟的绝大部分 microRNA。根据不同个体表达 microRNA差异情况，找出肝癌干细胞相对稳定表达的特征 microRNA,如果筛选后特征 microRNA仍然较多，适当增加样本 量进行实验。 Northern blot 进一步验证特征 microRNA。125 Northern印迹1.75%琼脂糖煮沸溶解，冷却到60 C, 加7 ml 10 x

9、MSE缓冲液、11.5 ml甲醛，加水定容至 70 ml，混 匀后倒入盛胶槽。等胶凝固后,去掉梳子和胶布,将盛胶槽放入1X MSE缓冲液的电泳槽。使 RNA变性，RNA4.5 ml, 10 x MSE缓 冲液20 ml、甲醛3.5 ml，去离子甲酰胺10 ml。55 C加热15 min, 冰浴冷却。加2 ml 5 x载样缓冲液，上样，同时加RNA标记物。60伏电泳过夜。取出凝胶，水中浸泡2次，每次5 min。室温下将胶浸到 50 mmol/L NaOH 和 10 mmol/L NaCl 中 45 min，水解 高分子RNA以增强转印。室温下将胶浸到 0.1 mmol/L Tris HCl(pH

10、7.5)中 45 min,使胶中和。20 x SSC洗胶 1 h。20 x SSC中 过夜转印到硝酸纤维素膜上。取出硝酸纤维素膜，80 C真空烘烤2 h。1.3 统计学分析 各分组所得计量数据采用均数土标准差(x s)表示，用 Prism 5软件处理数据，两组 间均数比较用t检验。检验水准 a 0.05。2 结果2.1 RNA 提取及质量鉴定结果 Trizol 一步法提取细胞中的 总RNA通过异丙醇沉淀法浓缩 RNA用分光光度计定量，样品总RNA的OD260/OD280直在1.82.0之间。甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果显示条带清晰，28S： 18S RNA条带亮度接近2 : 1,RNA 完好无降

11、解，质量符合miRNAs芯片的质量要求（见表1）。表1 RNA浓度和纯度测定2.2肝癌干细胞和卵圆细胞差异表达miRNAs芯片数据分析提取卵圆细胞和肝癌干细胞的总RNA利用microRNA芯片比较两种细胞表达miRNA差异情况。此芯片共包括人类238个microRNA,包括目前已经研究成熟的绝大部分microRNA。根据数据中上下调 1.5 倍筛选得到肝癌干细胞较卵圆细胞表达上调 的miRNA共有14个，下调的 miRNA有3个，最高表达变化达 7 倍。表达差异显著的 miRNA共有17个。具有显著统计学差异的 17种miRNA中，has-miR Plus 属于尚未被 miRBase数据库所记

12、 录，暂不列入研究范围；SV40-miR及hsv1-miR为病毒性miRNA也不列入研究范围。2.3 Northern 分析为了排除由于miRNA在芯片杂交前进行 扩增实验所造成的假阳性，笔者选择了 6个miRNAs进行Northern 杂交给予验证。包括 5 个高表达的 miRNAs：miR-520h、 hsa-miR-199a-3p 、hsa-miR-122 、miR-365、hsa-let-7f-2*和 1个低表达的miRNA miR-129。结果表明，与卵圆细胞相比较， 肝癌干细胞中 hsa-let-7f-2 表达升高约 5倍, hsa-miR-199a-3p 、 hsa-miR-12

13、2 表达升高约 6倍,与芯片结果符合率为 50%（图 1）。 其中 hsa-let-7f-2 被证明与干细胞关系密切, hsa-miR-122、 hsa-miR-199a-3p 与肝癌关系密切。注：采用 Northern 印迹技术对芯片筛选出的表达有显著差异的 miRNA进行验证，发现 hsa-let-7f-2(a)、hsa-miR-199a-3p(b)、hsa-miR-122 (c)在肝癌干细胞中的表达较卵圆细胞明 显升高，*P : 68。但微小RNA在肝癌干细胞中的作用尚无 报道。作为机体内源性 RNA miRNA很艮可能在肝癌起到重要的调 控作用。在研究中，人们对人 ESC细胞中的36种

14、miRNA进行了 文库性的克隆，之后研究了这些 miRNA的表达情况。结果发现其 中一些miRNA会在ESC细胞中特异性出现，其基因表达量在细胞 发育的过程中会逐渐下降。这些结果表明了，miRNA对于哺乳动物多能干细胞的发育起到了至关重要的作用。 此外，之前的研究 还发现这些miRNA具有高度的保守型9o对于干细胞的自我 更新和未分化状态的维持具有重要意义， 可作为胚胎发育早期和 未分化干细胞的分子标记物。miRNAs对干细胞的继续分化增殖 也具有显着的调节作用。在干细胞分化发育的过程中，miRNA的表达会出现变化， 而这种变化可以下调细胞内阻止干细胞分化的 基因，此外，miRNA还可以激活一些特定的基因，这些基因可以 决定干细胞发育后的分化方向10。另外，miRNAs也可以起 到癌基因或调节癌基因表达的作用。miRNAs控制了细胞的生长、 分化和凋亡，因此，这些 miRNAs表达的失调与肿瘤发生有关 11 13。本研究采用miRNA芯片技术发现肝癌干