现代生物技术第七章基因克隆策略与转基因技术

1、现代生物技术第七章基因克隆策略与转基因技术第七章 基因克隆策略与转基因技术一 基因克隆策略二 转基因技术基因克隆和转化技术是基因工程操作的主要组成部分，没有克隆就无法开展基因工程，没有简单有效的转化技术就难以实现外源基因的遗传重组。随着分子生物学技术和相关学科的发展，基因克隆和转化的新技术、新方法不断涌现。因此，有必要进一步了解这些技术方法的原理、操作和优缺点及其对因材选法，提高基因克隆和转基因效率的意义。 第一节 基因克隆策略一、一般克隆法(一)化学合成法一般方法是先将寡核苷酸激活，带上5磷酸基团，然后再与相应的互补的寡核苷酸片段退火，形成带有黏性末端的双链寡核苷酸片段。把这些双链寡核苷酸片

2、段混合在一个试管中，加上T4DNA连接酶，使它们彼此连接组装成一个完整的基因或基因的一个片段。这些组装的产物被插入到适当的载体上，并转化大肠杆菌寄主细胞。最后DNA序列分析所组装的基因。应用这种基因组装法，已经克隆出了多种基因，其中包括分子量较大的干扰素和组织纤溶酶原激活因子(tpA)等多个基因。 (一)化学合成法化学合成法关键是：最好在基因两个末端设有不同酶切位点，以便与载体进行有方向性的连接。合成的片段应该经过适当纯化，一般以PAGE或HPLC纯化较好，因为合成过程中有些片段不完整，必须除去。片段5端不宜过长，因为越长，成本越高，产量越低，而且出现错误的几率越大。连接时，应每四个两两互补片

3、断一同连接，然后每两组相连，最后和载体连接。转化克隆后，必须分析序列，予以确证。（二）DNA基因文库 1原理 通过一系列的酶促反应，使总Ploy(A)mRNA转变成双链cDNA群体，并插入到适当的载体分子，然后再转化到大肠杆菌寄主菌株的细胞内，如此便构成了包含着所有基因编码序列的cDNA基因文库(complement DNA gene library)。广泛使用的一种方法是，先用逆转录酶合成一条cDNA链，经碱降解作用，再用大肠杆菌DNA聚合酶I合成第二条链，最后用单链特性S1核酸酶消化掉cDNA单链部分，形成双链的cDNA，与载体连接后，转化宿主细胞，产生千万个克隆，即为cDNA文库。2不同

4、丰度mRNA的cDNA克隆 在许多组织和细胞中，各种mRNA的含量都是极不相同的。其中，有些类型的mRNA含量十分丰富，每个细胞可拥有数干个拷贝，而有些类型的mRNA每个细胞只有少数几个拷贝。 对于稀少mRNA，可以通过蔗糖梯度离心及变性条件下的凝胶电泳，分离以后富集。也可以根据已知核酸序列，合成互补的核苷酸序列，在Ploy(A)RNA的逆转录反应中，这些寡核苷酸序列可以作为引物，合成cDNA并建成文库。如果合成的寡核苷酸有足够的长度(1440个核苷酸)，还可直接作为探针，从cDNA基因文库中筛选含有目的基因序列的克隆。 3cDNA克隆特点cDNA克隆以mRNA为起始材料，这对于有些RNA病毒

5、，例如流感病毒，cDNA克隆就成为一种惟一可行的方法。cDNA基因文库的筛选比较简单易行，一个完全的cDNA基因所含的克隆数，要比一个完全的基因组文库所含的克隆数少得多。理论所必需的最低克隆数，约为1.7105个克隆。如果某一特定的基因克隆，目的在于获得一种特殊的真核蛋白质产物，涉及它的蛋白质的检测，则必须用cDNA库法。在已知基因组DNA序列酌情况下，通过同cDNA序列的比较，还可以确定出内含子和外显子之间的界线。另外，cDNA片段小，序列分析方便。在发育过程中时间调节基因表达特征的分析，以及组织特异性基因表达特性的分析，都要使用cDNA克隆。鉴定出在某种类型细胞中存在，而在同种类型细胞不同

6、处理中又不存在的mDNA分子的cDNA克隆，如差异显示等。用cDNA文库制成表达芯片很容易进行基因表达分析。 (三)基因组文库基因组文库是指由来自染色体DNA的全部DNA片段组成的基因文库。理论上，在一个完整的基因组文库中，生物体的每一个基因都有一个克隆。 构建基因组文库的第一步是，从目的生物体中制备基因组DNA，根据建库所用载体容量大小制备适宜的DNA片段。应注意的是，分离的DNA片段最小应为载体容量的2倍以上。构建基因组文库的第二步是，在体外将这些DNA片段同适当的载体连接，形成重组体分子，转化大肠杆菌细胞，经过生长扩增之后，组成了一个重组体克隆库，此即是基因组文库。一个构建理想的文库，应

7、该对任何一个已知基因均可从文库中筛选出来。关于基因组文库的几个要点：使用任何一种扩增的基因文库时，同一重组体群体中所有的成员都不是等速地增殖。插入的外源DNA在大小及序列上的差异，将影响到重组载体的复制速率。这样，当一个基因文库经过了扩增之后，某些特定的重组体的比例就可能增加，而有些重组体的比例则可能下降，甚至会丢失。用已知探针筛选出阳性克隆，并不一定是单一的完整的目的基因。由于DNA片段是随机的，可能酶切到基因的一部分；或者基因很大，载体容量不够，很可能被漏掉；或者靶基因两端有一些其他序列，尤其是大容量载体库，更容易产生此结果。如果需要得到基因完整的序列，必须用基因组文库方能达到，有利于价究

8、内含子、启动子和调控序列结构和功能。理论上讲，除少数基因外，一个基因组含有不同基因数量相等，即获取的机会相同。保留了基因组文库相当于保存了整个基因组，对于濒临灭绝的生物或许是延续物种的一种办法。(四)PCR技术聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA的方法，故又称为基因的体外扩增法。二、功能克隆法(一)双抗体法早期人们克隆目的基因采用一种双抗体技术。由于抗体的特异性，它只对特种抗原产生反应，可以用已知蛋白质免疫制造特异性抗体。用此抗体与特定细胞的胞质进行反应。因为细胞中不断在核糖体与mRNA复合体上翻译出长短不一的

9、靶蛋白，这些蛋白与复合体一起与特异性抗体产生反应，结合在一起。然后再用抗体与它们反应，生成更大的颗粒。通过超速离心即能使其从细胞质中分离出来。最后用蛋白酶降解蛋白质，可以得到特异的mRNA，以01igodT为引物，逆转录合成cDNA经克隆即可得到目的基因。(二)反向生物学法原理 已知蛋白质序列可以根据它的密码组成，合成出寡聚核苷酸探针，再从DNA文库中分离出目的基因克隆。另外，自然界中有一些蛋白质的核苷酸编码序列，在其进化的过程中保持着高度的保守性，这样就使核酸的种间杂交成为可能。(三)表达文库法将cDYA克隆在表达载体上，再导入大肠杆菌构成cDNA表达文库。然后通过对蛋白质产物的鉴定，分离克

10、隆真核目的基因。用于构建表达文库的载体，可以是质粒载体，也可以是从噬菌体载体发展而来的原核表达载体。表达的蛋白质以融合蛋白质形式合成，不易被原核细胞中的有关的蛋白酶消化降解，可以得到较高的表达水平。三、表性克隆法 (一)差异杂交差异杂交又叫差异筛选。它特别适用于分离在特定组织中或发育的特定阶段表达的基因以及受生长因子调节的基因，亦可有效地分离经特殊处理诱导表达的基因。1差异杂交原理 差异杂交的技术只需要拥有两种不同的细胞群体，在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。这样两种不同细胞群体的DNA提取物中，一个群体含有一定比例的目的基因DNA。另一个群体不含有。因此，以

11、这两种总mRNA(或是它们的cDNA拷贝)为探针，分别对由表达目的基因的细胞群体构建的cDNA文库进行筛选。当以目的基因表达的DNA群体为探针时，所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应；而以目的基因不表达的DNA群体为探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应。比较这两种结果并对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落。2差异杂交技术的局限性 差异杂交的灵敏度比较低，特别是对于那些低丰度的mRNA。这是因为在差异杂交中所使用的杂交探针，仅有极少的一部分能与目的基因核苷酸序列完全互补，所以那些低丰度的DNA很难用此法检测出来。另外，差异杂交需要筛选大量的杂交膜，鉴定大量的噬菌斑，因此

12、十分耗时费力。（二）衰减杂交技术衰减杂交原理 衰减杂交的本质是除去那些共同存在的cDNA序列，使欲分离的目的基因的序列得到有效的富集，提高分离的敏感性。从表达目的基因的组织(记作)提取mRNA逆转录为cDNA，然后与无目的基因表达的组织(记作)提取的mRNA做过量杂交，在组织与组织中均表达的基因产物形成cDNA mRNA双链杂交分子，而特异mRNA逆转录的cDNA仍保持单链状态，将此种杂交混合物通过羟基磷灰石柱，DNADNA杂交分子便结合在柱上，而游离的单链cDNA则过柱流出。(三)差异显示技术差异显示技术可以从一对细胞群体或一对基因型各自产生的约15万种mRNA中，有效地鉴定并分离出差异表达

13、的基因。差异显示技术的原理 其原理是以一类与mRNA的plyA结合的寡核苷酸序列作为锚定引物，进行逆转录，形成mRNADNA杂交分子。再加入另一短的随机序列l0聚体作为引物，进行PCR反应，然后用聚丙烯酰胺凝胶显示扩增片段。（四）代表性差异分析技术代表性差异分析技术原理 试验对象(tester,T)和供试探针(driver，D)在接受差异分析前，均用一种识别4碱基序列的限制性内切酶做切割处理，形成平均长度为256bp的DNA片段代表群，保证绝大多数遗传信息能被PCR扩增。第一次T与D杂交反应时两者总量比为1100，第二次增加到1400，第三次则为180000，T群体相非特异性序列几乎没有偶然逃

14、脱的可能。另外，T减D反应后仅设置了72复性与延伸和95变性这两个参数，共20个循环，从而使PCR产物的特异性及所得的探针纯度均大为提高。四、插入分离法此类技术多用于植物基因分离。当一段特定的DNA序列插入到植物基因组中目的基因的内部或其邻近位点时，使会诱发该基因发生突变，并最终导致表型变化，形成突变体植株。用此DNA作为杂交的分子探针，从突变体植株的基因组DNA文库中筛选到突变的基因。而后再利用此突变基因作探针，就能从野生型植株的基因组DNA文库中克隆到野生型的目的基因。这样插入的DNA序列相当于在植物基因上贴了一张标签，因此DNA插入突变分离基因的技术，又叫做DNA标签法。主要包括转座子标

15、签法和TDNA标签法两种类型。第二节 转基因技术动物转基因技术植物转基因技术微生物转基因技术报告基因和选择标记一、动物转基因技术将外源DNA导入哺乳动物细胞的方法原则上可大致分为三类：生物方法、物理学方法和化学方法。在化学方法中最常用的有磷酸钙沉淀法、DEAE葡聚糖转化法和脂质体转化法。在物理方法中，有电穿孔法，还有其他用于较为特殊的情况下的方法，如基因枪轰击法、受体介导的基因导入法等。在生物方法中，目前主要是把病毒作为外源DNA导入的工具，通过病毒感染将外源DNA导入细胞中。这种方法的优点在于它具有较高的转化效率，并能在一定的条件下实现对特定细胞的靶向性，目前主要用于基因治疗的研究中。一、动

16、物转基因技术根据不同的实验目的，外源DNA导入哺乳动物细胞又可分为瞬时转化和稳定转化。瞬时转化一般是外源DNA导入细胞14d后收获转化细胞，对转化基因的转录和复制进行分析。稳定转化则需要使外源基因整合于细胞染色体，从而得到稳定的转化细胞株。一、动物转基因技术 1磷酸钙沉淀法 如果核酸和磷酸钙以共沉淀物颗粒形式存在，细胞将显著增加其摄取核酸的能力，这一现象是磷酸钙转化方法的基础。磷酸钙转化中要用较高浓度的DNA(1050g)。一、动物转基因技术 2DEAE葡聚糖转化法本方法简单，重复性好，适用于瞬时表达。在DEAE葡聚糖转化中，加入的细胞数量、DNA浓度及DEAE葡聚糖的浓度，对于优化转化效率是

17、最为重要的。 3脂质体介导的转化 一般认为，DNA上带负电的磷酸基团与脂质体上的正电荷结合，然后脂质体上剩余的正电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，然后通过二者的融合将DNA导入细胞。 4电穿孔转化法 电穿孔方法是应用高压电场在细胞上穿孔，将DNA导入细胞，DNA通过所穿的孔而扩散进入细胞中，然后细胞恢复正常功能，从而使导人基因得到表达。这项技术不依赖细胞的特性，所以可用于几乎所有类型的细胞。 5基因枪轰击法 是将外源基因DNA导入植物细胞及哺乳动物细胞的方法。 基本的操作方法是：在真空状态下，利用粒子加速器将外面包裹了外源基因DNA的金颗粒打入完整的细胞中，使外源基因DNA得以在靶细胞中

18、稳定转化并有可能获得表达。金颗粒直径的大小取决于靶细胞直径的大小。在通常情况下，颗粒直径为1.0m时可获得成功和稳定的转化。金颗粒的形状和直径的大小非常均匀，且毒性很低。其缺点主要就是价格相对昂贵，金颗粒DNA的包裹效率相对不稳定。6受体介导的基因导入法 受体介导的基因导入法主要应用于基因治疗的研究。 外源基因导入体内的方式可分成两类：间接体内方式和直接体内方式。间接体内方式是从供体分离出细胞，在体外转染外源基因，经选择和培养后返输回供体内。受体介导的基因导入法的基本原理，是基于人工合成的已知受体配基与多聚阳离子(一般是多聚赖氨酸或阳离子表面活性剂)偶联形成的连接物，既能通过电性作用结合并浓缩

19、DNA分子成为可溶性颗粒状物质，又不失去与细胞膜受体结合的功能，因而能通过配体/受体介导的内吞作用，将此复合物导入细胞。其中很少一部分DNA从内吞小体逸出，并进入细胞核实现功能基因的表达。一、动物转基因技术 7显微注射技术 应用玻璃显微注射器，可以把重组DNA直接注射到哺乳动物细胞的细胞质或细胞核。通常根据DNA注射的不同方式，可以把显微注射区分为(真正的)显微注射和穿刺两种。真正的显微注射是由注射针直接将重组DNA注入细胞，而穿刺的重组DNA处在细胞周围培养基中，然后随穿刺形成的小孔进入细胞内部。一、动物转基因技术 8精子载体介导法 精子载体介导法是利用一定的方法先将外源基因附着在精子上，然

20、后通过受精过程将外源基因带入卵子中。目前由于对精子载体介导法的作用机制尚缺乏了解，对其可靠性仍有争议，限制了此方法的广泛使用。随着该方法的不断完善，将有可能成为一种简单有效的转基因技术。一、动物转基因技术 9胚胎干细胞介导法 胚胎干细胞介导法是利用转化技术，将外源基因导入未分化的全能性胚胎干细胞中，外源基因通过同源重组整合到细胞染色体基因组特定的位点上，然后将其注入囊胚腔中，发育成携带有外源基因的动物个体。该方法的最大特点是外源基因能根据需要定位整合到细胞染色体基因组的特定位置上，为研究某种基因在动物发育过程中的作用及定点突变提供了一个强有力的手段。该方法的另外一个特点是整合率高达50，但所形

21、成的转基因动物是嵌合体。这种动物体内一部分组织或器官含有外源基因，只有外源基因整合到生殖细胞中，下一代才可形成转基因动物。一、动物转基因技术 10哺乳动物细胞基因打靶 基因打靶技术，通过在转染细胞中发生的外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变细胞遗传特性的目的。 基因打靶的分子基础是，两条具有同样或类似核苷酸序列的同源DN分A子之间发生的遗传信息的重组事件。这也就是说，基因打靶的一个基本条件是，在外源打靶基因与内源核基因组目标基因之间，必须存在一段适当长度的同源的DNA序列。二、植物转基因技术 (一)植物基因转化受体系统 植物基因转化受体系统应具备如下条件：再生能力。用于植物基因转化的外植体，必须易于再生，有很高的再生频率，并且具有良好的稳定性和重复性。遗传稳定性。植物受体系统接受外源DNA后应不影响其分裂和分化，并能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传的稳定性，尽量减少变异。外植体来源。基因转化的频率很低，需要多次反复地实验，所以就需要大量的外植体材料。转化的外植体一般采用无菌实生苗的子叶、胚铀、幼叶等，或采用可进行快速繁殖的材料。对选择条件敏感