生物化学实验报告

1、吉林大学国家级生物试验教学示范中心试验报告姓名：周秀丽课程吉林大学国家级生物试验教学示范中心试验报告姓名：周秀丽课程：生物化学试验题目：啤酒酵母蔗糖酶提取、分别纯化、性质鉴定及反响动力学试验 10第 10第30 页学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：一、试验目的：1、生疏工作曲线的制作方法及留意事项；2、把握 3, 5-二硝基水杨酸DNS比色定糖的原理和方法；3、把握 Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；4、把握酶蛋白分别提纯的原理；5、把握酶的比活力测定及其计算方法；6、把握酶促反响动力学中用双倒数法测定Km 的方法；7、运用正交

2、试验法确定温度、pH 值、离子浓度的最适条件。称量技术：1、了解电子天平的用途2、了解电子天平的工作原理3、把握电子天平的使用方法4、把握电子天平使用前后的留意事项离心技术：1、了解离心机的根本原理和用途2、了解离心机的类型和用途3、了解离心机的型号和把握版面4、把握离心机的使用方法5、把握离心机使用的留意事项层析技术：1、了解层析技术的根本原理2、了解层析技术的分类状况3、了解各种层析技术的原理4、把握凝胶层析技术光谱分析技术：1、学习把握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理2、了解仪器构造和分类3、娴熟把握常用仪器的使用方法和留意事项电泳技术：1、了解电泳的根本原理2、了解电泳的类型学号：

3、45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：3、学习SDS-测定蛋白质分子量的原理4、把握垂直板电泳的操作技术5、把握琼脂糖凝胶电泳的操作技术6、了解转移电泳的根本原理和操作方法7、了解双向电泳的根本原理和操作方法二、试验原理：1、蔗糖酶的提取：酵母菌的根本特征：单细胞，椭圆形、圆形或柱形。长5-30m，宽 1-5m。生物材料裂开方法：机械匀浆法 研钵 玻璃或Teflon研棒匀浆器50mLTeflon：聚四氟乙烯先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞裂开程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。 高速组织捣碎机

4、0.5-1L将材料配成稀糊状液，放置于筒内约 1/3 体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 高压匀质机XL高压下的细胞通过阀门流出时，细胞内外压力同时降低，但由于细胞膜的作用，胞外压力瞬间降至常压，而胞内压力相比之下降低较慢，从而在细胞内外形成压力差，使细胞膜裂开。优点：快速 ，产热小，对蛋白损伤小，裂开效率高。一次裂开效率可达90%以上超声波处理法用肯定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡裂开，此法多适用于微生物材料，常在 30 至60Hz 频率下处理 10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应实行

5、相应降温措施。反复冻融法将细胞在 -20 度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀，使细胞构造裂开。设备简洁、效率不高，时间长，留意蛋白酶！化学处理法有些动物细胞可承受十二烷基磺酸钠 (SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：溶胞作用 (酶溶解法)用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶、-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等。自溶法将颖的生物材料存放于肯定的 pH 和适当的温度下，细胞构造在自身所具有的各种水解酶如蛋白酶和酯酶等的作用下发生溶解，使细胞内

6、含物释放出来。2、蔗糖酶的纯化：酶与蛋白质纯化过程的独有特点：特定的一种酶在细胞内的含量很少纯化困难可以通过测定活力的方法加以跟踪查找关键酶的纯化方法：酶的蛋白属性；两性电离：蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在肯定的溶液 pH 条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。等电点 (isoelectric point, pI)：当蛋白质溶液处于某一 pH 时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为pH 称为蛋白质的等电点。大分子(胶体)：1 100 万之巨，其分子的直径可达 1100nm，为胶粒范围之内。稳定的因素： 颗粒外表电荷 水化膜调整酶溶解

7、度的方法；有机溶剂分级沉淀转变离子强度； 盐析 硫酸铵分级沉淀 反抽提法反抽提法Back Extraction例：E.coli RNA 聚合酶 42% - 50% 硫酸铵饱和度时沉淀通常方法：先 33%-再 50%反抽提法：再 42%将包含待分别酶在内的多种蛋白一起先沉淀出来，然后再选择适当的递减浓度的硫酸铵溶液来抽提沉淀物。 蛋白从溶液中沉淀析出格外简洁，沉淀在溶液中溶解有高特异性。学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：转变pH 或温度；改酶变在介未电纯常化数之；前 PI 也是未知的，pH 不宜变化过大，以免失活。Cu,Zn-SOD 的纯化

8、可在 70 oC，10 min。转变介电常数；有机溶剂分级沉淀：向水溶液中参加肯定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分别纯化方法。亲水性有机溶剂参加溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚拢形成沉淀。亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了外表水化膜的厚度， 降低其亲水性，导致脱水凝集。有机溶剂分级沉淀操作条件的把握：溶剂选择：常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。温度：使用有机溶剂沉淀生物大分子时应把握在低温下进展。样品浓度的把握

9、：一般认为蛋白质的初始浓度为 0.5%-2% 为好。依据酶分子大小、外形不同的分别方法；透析、凝胶层析离心分别；最为常用 分布在细胞器 匀浆后离心透析、超滤；利用具有肯定孔径的亲水膜，在常压下依靠小分子物质的集中运动，将含有高分子和其他小分子的溶液与纯水或缓冲溶液分隔的一种方法.用于去除大分子溶液中的小分子物质，称为脱盐。用于去除大分子溶液中的溶剂，此称为浓缩。凝胶层析； 凝胶层析的定义：凝胶是一种具有多孔、网状构造的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、外形不同的分子进展层析分别，称凝胶层析凝胶层析常见名称：凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析。凝胶层析的根本原理：凝胶层析是利用凝胶把分

10、子大小不同的物质分别开的一种方法，其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状构造，路径长、流速慢，以至最终流出柱外。凝胶层析的应用范围：凝胶层析法适用于分别和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质 的溶液进展脱盐、浓缩、去热源和脱色。凝胶层析的特点：

11、凝胶层析操作简便，所需设备简洁； 分别效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100； 分别条件缓和。凝胶骨架亲水，分别过程又不涉及化学键的变化，所以对分别物的活性没有不良影响； 应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分别纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。 分别的分子量范围很宽，如 Sephadex G 102105D；Sepharose 105108D。依据酶分子电荷性质的分别方法；离子交换层析离子交换层析根本原理 ：以离子交换剂为固定相，以特定的离子溶液为流淌相，利用离子交换剂对待分别的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进展分别的层析技术。离子交换分

12、别的根本步骤-平衡-上样-吸附-洗脱-再生如何选择离子交换介质：pI=5 的某酸性蛋白质， 当蛋白质为阴离子时，在 pH5.5-9.0 的范围内应选阴离子交换剂； 当蛋白质为阳离子时，在 pH3.5-4.5 的范围内应首选阳离子交换剂离子交换纤维素：骨架松散、亲水性强、外表积大、交换容量大、吸附力弱、交换和洗脱条件温存、区分率高； 离子交换纤维素的预处理：适量水浸泡，漂洗，使之充分溶涨；数十倍的0.5mol/L 氢氧化钠液反复浸泡 0.51h，每次换液皆须用水洗至近中性； 按交换的需要用平衡离子处理； 最终以交换用缓冲液平衡备用。依据酶分子专一性结合的方法;学号：45110709 时间：202

13、2/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：亲和层析技术； Bioaffinity 生物亲和作用查找可与蛋白专一性结合的配基；将配基L通过共价键偶联到载体，并使L P 亲和力不变；L P 吸附并与杂质分别，将杂质洗出；洗脱目标物，实现纯化。亲和超滤；亲和高度专一性超滤高处理力量金属亲和层析利用金属离子的协作或形成螯合物的力量吸附蛋白质的分别系统。蛋白外表暴露的供电子氨基酸残基 咪唑基、巯基、吲哚基。Cu 和 Zn 可以很好的与咪唑基和巯基结合。优点： 蛋白质吸附容量大； 价格廉价投资低； 具有普遍适用性；拟生物亲和层析利用局部分子相互作用，模拟生物分子构造或特定部位，以人工合成的配基

14、为固定相吸附目的蛋白的亲和层析，尤以氨基酸包括多肽亲和层析为代表。3、各纯化级别蔗糖酶的活性测定：酶活力 (enzyme activity)酶催化某一反响的力量VV单位时间内单位体积中底物 (substrate) 的削减量或产物 (product) 的增加量。条件：1、催化反响总的反响式；2、酶是否需要某种关心因子(cofactors)；3、酶最适时的pH 和温度。25 37。1、测定酶活力时应留意几点应测反响初速度 (initial velocity or initial speed)(如每分钟底物转换的mol)酶速度 (velocity)：酶催化反响的速率，酶速度通常记录为时间为 0 时的

15、值 (符号 V0 :mol学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：min)，以零时点为起点作一与曲线的线性局部相切的直线，这始终线的斜率即等于V0。测酶活力时应使反响温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。测定酶反响速度时，应使 SE。S的选择原则：线性范围越宽越好，但不宜太大2、酶活力和比活力表示方式酶活力单位：国际单位I：在特定的条件下，每分钟催化1mol催量单位ka：在特定条件下，每秒钟使1mol底物转化为产物所需的酶量。1 IU= 16.6710-9 kat酶的比活力 (specific activity，也称比活性比活力：指每m

16、g 蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg 蛋白质来表示。比活力= 酶活力U/ml/蛋白质浓度mg/ml比活力有时也可用每g 或每ml 酶含多少个活力单位来表示活力 (或总活力)涉及在样品中酶的总单位，而比活力是酶纯度的量度，是每毫克酶的催化活力数(U/mg 蛋白)。在酶的纯化过程中它的比活力渐渐上升，当酶提纯时，其比活力值成为最大和恒定。3、 酶活力的测定方法最便利的测定：测量产物消灭的速率或底物的消逝速率1、底物(或产物)在特别波长下吸取光2、 NADH 和 NADPH3、酶联测定法没有适用于底物和产物的适宜吸取波长，或者说“无色”4、各纯化级别蔗糖酶的蛋白浓度测定：紫外吸取法：原理：大多数

17、蛋白质由于有酪氨酸和色氨酸的存在，在紫外光 280nm 有吸取峰，可以进展蛋白质含量的测定。计算公式： 蛋白质含量(mg/ml)=1.55A2800.76A260 紫外吸取法优点：样品不需要经过预先处理，即可直接进展测定。方法简洁而快速，又不损害样品中的蛋白质， 测定之后的样品仍可作他用。样品中有硫酸或其他盐类存在也不影响测定。在柱层析分别酶或蛋白 质时，常为人们所承受。缺点：核酸在 280nm 也有吸取，干扰测定，但核酸的最大吸取峰在 260nm。不同蛋白质的氨基酸组成也不同，因而光吸取也不尽一样，这就会带来误差。学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C46

18、2教师签字：双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，至令仍广泛承受。 原理: Cu2+ 与蛋白质的肽键络合，形成紫红色络合物，此络合物在 540nm 波特长有最大吸取，是一种快速测定蛋白质的方法，但其灵敏度较低。 优点：是一种快速测定蛋白质的方法。 Tris 缓冲液等。Folin-酚法 (Lowry 法)这是测定蛋白质含量最灵敏的经典方法之一，由于方法简便，灵敏度高，常为试验室所承受，也是文献上用得最多的方法之一。凡含有两个及两个以上肽键(-CO-NH-) 的化合物在碱性溶液中 (如 Folin-甲试剂) 都能与Cu2+ 作用，形成紫色的复合物；全部的蛋白质均可与 Folin-

19、甲试剂反响形成紫色的铜-蛋白质复合物；铜-蛋白质复合物在 pH=10 的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸 (Folin-乙试剂) 复原成兰色的钼(在肯定范围内)与蛋白质的含量成正比。干扰物质与双缩脲法一样，而且受它们的影响更大。三种蛋白质测定方法比较方法紫外吸取法灵敏度灵敏度较高50100 g，比色杯的最小测量体积为0.1ml原理蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸取干扰物质各种嘌吟和嘧啶、各种核苷酸双缩脲法Biuret 法灵敏度低120mgFolin-酚法Lowry 法灵敏度高5g多肽键碱性Cu2产生紫色络合物双缩脲反响；磷钼酸磷钨酸试剂复原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物硫酸铵、各种硫醇T

20、ris缓冲液、硫酸铵、Tris缓冲液、各种硫醇、酚类、柠檬酸蛋白含量测定的计算样品的测定：取两支试管平行各参加样品液稀成肯定浓度的1ml ，其他操作反响和比色学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：测定同工作曲线的制作蛋白含量测定的计算Pro(mg / ml) A650值对应的ug数(Pr)*103Pro溶液的ml数*稀释倍数5、正交试验法测定不同条件对蔗糖酶活性的影响：正交试验设计 (Orthogonal experimental design)是争辩多因素多水平的一种设计方法，它是从全面试验中选择出局部有代表性的点进展试验，这些有代表性的点

21、具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分析式因设计的主要方法。是一种高效率、快速、经济的试验设计方法。日本有名的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格，称为正交表。全面试验法的优缺点：缺点：(1) 试验次数太多，费时、费事，当因素水平比较多时，试验无法完成。不做重复试验无法估量误差。无法区分因素的主次。优点：对各因素于试验指标之间的关系剖析得比较清楚简洁比较法的优缺点优点：试验次数少缺点：试验点不具代表性。考察的因素水平仅局限于局部区域，不能全面地反映因素的全面状况。无法分清因素的主次。假设不进展重复试验，试验误差就估量不出来，因此无法确定最正确分析条件的精度。无法利用数

22、理统计方法对试验结果进展分析。正交试验的提出：考虑兼顾全面试验法和简洁比较法的优点，利用依据数学原理制作好的规格化表正交表来设计试验不失为一种上策。用正交表来安排试验及分析试验结果，这种方法叫做正交试验法。正交试验法优点：试验点代表性强，试验次数少。不需做重复试验，就可以估量试验误差。可以分清因素的主次。可以使用数理统计的方法处理试验结果。正交试验表法的特点：学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：均衡分散性代表性。整齐可比性可以用数理统计方法对试验结果进展处理。指标、因素和水平：试验需要考虑的结果称为试验指标简称指标可以直接用数量表示的叫定量

23、指标；不能用数量表示的叫定性指标。定性指标可以按评定结果打分或者评出等级，可以用数量表示，称为定性指标的定量化。试验中要考虑的对试验指标可能有影响的变量简称为因素，用大写字母A、B、C表示每个因素可能出的状态称为因素的水平简称水平正交试验结果分析极差分析法：分析内容：3 个因素中，哪些因素对转化率影响大，哪些因素影响小；假设某个因素对试验数据影响大，那么它的哪个水平对提高转化率有利。6、蔗糖酶酶促反响动力学争辩：酶促反响动力学(Kinetics of enzyme-catalyzed reaction )酶促反响动力学是争辩酶促反响的速度以及影响此速度的各种因素的科学，是酶工程争辩中的一个重要

24、内容。影响酶促反响速度的因素 pH 值在肯定的pH 下,酶具有最大的催化活性, 通常称此pH 为最适pH。 带电状态； 酶的稳定性； 温度温度上升，酶促反响速度加快。温度上升，酶的高级构造将发生变化，导致酶活性降低甚至丧失。 大多数酶都有一个最适温度。 在最适温度条件下，反响速度最大。在适宜的温度范围内，温度每上升10，酶促反响速度可以相应提高12 倍。 酶浓度假设底物浓度足够大，足以使酶饱和，则反响速度与酶浓度成正比。 底物浓度低底物浓度： 正比 一级；全部的酶都与底物结合: Vmax,反响速度恒定 零级反响。在实际测定中：底物浓度足够高，再上升酶的浓度，反响速度未增加抑制。吉林大学国家级生

25、物试验教学示范中心试验报告姓名：周秀丽课程：生物化学试验题目：啤酒酵母蔗糖酶提取、分别纯化、性质鉴定及反响动力学试验 学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：缘由： 高浓度底物降低了水的有效浓度，降低了分子集中性，降低了酶促反响速度； 过量的底物聚拢在酶分子上，生成无活性的中间产物，不能释放出酶分子，从而也会降低反响速度；酶促反响动力学方程式米氏学说：VVmax S0K SmS： 底物浓度m： 米氏常数Vmax：最大反响速度V： 不同S时的反响速度米氏常数Km的意义：Km 值是酶的特征常数之一，只跟酶的性质有关，而与酶的浓度无关。Km 值作为常

26、数只是对肯定的底物、肯定的pH、肯定的温度条件而言，测定酶的Km 值可以作为鉴别酶的一种手段。1/ Km可以表示酶对底物亲和力的大小, 1/ Km越大, 说明亲和力越大, 多底物酶有不同的 Km值, 最适底物的Km值最小。V=Vmax/2 时，米氏方程变换为：Vmax VVmaxS2KSmV = 1/2 Vmax, Km = S米氏常数是反响速度为最大值的一半时的底物浓度。米氏常数的单位为mol/L。Km 和 Vm 的测定：双倒数作图法：将米氏方程两边取倒数，可转化为以下形式：1KmVV 1 1SVmaxmax1/V 1/S作图得始终线，其斜率是Km/Vm1/Vm,横轴上的截距为-1/Km。抑

27、制剂对酶活性的影响：使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂。酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：11 30 页吉林大学国家级生物试验教学示范中心试验报告姓名：周秀丽课程：生物化学试验题目：啤酒酵母蔗糖酶提取、分别纯化、性质鉴定及反响动力学试验 学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：在化学构造上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相像。能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体。抑制剂的作用方式不行逆抑制：抑制剂与酶反响中心的活性基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活。可逆抑制：抑制剂

28、与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性临时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能局部或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的状况，又可以分为两类竞争性抑制和非竞争性抑制) 参加竞争性抑制剂后，Km 变大，酶促反响Vmax 不变。1.0参加非竞争性抑制剂后，Km 不变，但由于Vmax 减小，所以酶促反响速度也下降了。0.810.60.40.20.0-4-20268101/S(1/mmol.L-1)激活剂对酶活性的影响但凡能提高酶活性的物质，都称为激活剂，分为三种：1、无机离子：金属离子、阴离子氯离子、溴离子和氢离子等。2、中等大小的分子：谷胱甘肽、EDTA乙二胺四乙酸等。3、具有蛋白质性质

29、的大分子物质，如酶原的激活中起作用的酶。SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SodiumDodecylSulfate,PolyacrylamidGelElectrophoresis,12 30 页吉林大学国家级生物试验教学示范中心试验报告姓名：周秀丽课程：生物化学试验题目：啤酒酵母蔗糖酶提取、分别纯化、性质鉴定及反响动力学试验 学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：SDS-电泳：是指带电粒子在电场的作用下，发生定向 泳动的现象。电泳技术：指利用电泳现象对混合物进展分别分析的技术。蛋白质分子状态在自然状态下蛋白质通过二硫键聚合形成高度折叠的生物大分子

30、，在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质分子形成带有肯定净电荷的分子, 在电场下向自身电荷相反的方1.0向移动。10.80.60.40.20.0-4-20268101/S(1/mmol.L-1)聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶 (polyacrylamide gel) 是由单体 (monomer) 丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 和交联剂 (crosslinker) N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N,methylenebisacrylamideBis) 在催化剂过硫酸铵(AP) 和加速剂 (TEMED) (简称) 。聚丙烯酰胺凝胶优点：孔径可调整;透亮，有弹性，机械性能好;

31、化学性能稳定;具有高区分率和灵敏度;重复性好;凝胶杂质少;连续系统电泳体系缓冲液pH 值及凝胶浓度一样，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统电泳体系由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分别条带清楚度及区分率均较前者佳。13 30 页吉林大学国家级生物试验教学示范中心试验报告姓名：周秀丽课程：生物化学试验题目：啤酒酵母蔗糖酶提取、分别纯化、性质鉴定及反响动力学试验 学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-：

32、1、复原剂的解聚作用在蛋白溶液和分别凝胶介质中参加复原剂-巯基乙醇(- mercaptoethanol)或二硫苏糖醇(Dithiothretiol, DTT)蛋白质分子在复原剂作用下二硫键被复原将多聚体或单链折叠的蛋白质分子的二硫键翻开，形成长短不一的单链亚基。2、电荷效应SDS 分子中含有大量的带负电的磺酸基，包裹蛋白形成带负电荷的蛋白质亚基分子，称之为蛋白质-SDSSDS 与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS: 1g 蛋白质。蛋白质-SDS 复合物在水溶液中的外形象一个长椭圆棒。这种棒状物的长短与亚基的分子量大小成正比。在电场下，蛋白质-SDS 复合物就会向正极移动，可以测定蛋白质的分

33、子量。3、浓缩效应凝胶层的不连续性； 浓缩胶：大孔胶；分别胶：小孔胶缓冲液离子成分及pH的不连续性；电位梯度的不连续性。4、分子筛效应pH= 8.8SDS复合物，甘氨酸和Cl-的界面很快超过蛋白质SDS 复合物。蛋白质SDS 复合物在分别胶中以本身的电泳迁移速度进展电泳，向正极移动。由于蛋白质 SDS 复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分别胶，进入分别胶后，由聚丙烯酰胺的分子筛作用而被分别。分子筛效应：是指样品通过肯定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小挨次排列成相应的区带。由于分别胶的孔径较小，分子量大小或分

34、子外形不同的蛋白质通过分别胶时，所受阻滞的程度不同，因而迁移率不同而被分别。14 30 页吉林大学国家级生物试验教学示范中心试验报告姓名：周秀丽课程：生物化学试验题目：啤酒酵母蔗糖酶提取、分别纯化、性质鉴定及反响动力学试验 学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：四、结果及争辩DNS试管号12345678浓度00.40.81.222.83.64A54000.0460.1390.1920.3740.5460.7050.770folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作试管号1234567mBSA02550100150200250A65000.07

35、50.1690.2920.4180.5840.72422 30 页吉林大学国家级生物试验教学示范中心试验报告姓名：周秀丽课程：生物化学试验题目：啤酒酵母蔗糖酶提取、分别纯化、性质鉴定及反响动力学试验 学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：E1.E2.E3E1.E2.E3样品稀释倍数A540葡萄糖含量/mgE/U/ml100.32822.9332131.9400E1200.19191.7945161.5050500.13541.3225297.5625E2501000.42110.15083.70931.4511834.5925652.9950

36、51.660514.0635316.4288E3200.98808.4453760.0770500.26882.4369548.3025数据处理1E = 葡萄糖mg 数4.5/0.5E 的的稀释倍数/2ml= U/ml2总活力：EV3Pr：查标准曲线总Pr 量：PrV比活力：E/Pr or 总活力/总Pr 量阶段收率：E2 活力/E1 活力、E3 活力/E2 活力总收率：E3 总活力/E1 总活力提纯倍数：比活力n/比活力n-1，n=1，2，3蔗糖样品蛋白浓总蛋酶体酶浓度总活力度白量比活力提纯倍阶段收总收率酶样品积mlu/mlumg/mlmgu/mg数率%E16787.97505894.325

37、019.01512744.627E215445.83756687.56250.5007.559.44512.8475.068E310328.72503287.25000.0940.94349.7075.8830.73755.77%第 23 30 页吉林大学国家级生物试验教学示范中心试验报告姓名：周秀丽课程：生物化学试验题目：啤酒酵母蔗糖酶提取、分别纯化、性质鉴定及反响动力学试验 学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：稀释倍数A650Pro(mg/ml)稀释倍数A650Pro(mg/ml)A650A650值对应的g数(Pr)Pr(mg/ml)1

38、0-41000.5419191.071419.1072000.2903101.214320.243200.065620.96430.419500.04112.17860.60910.280497.67860.977样品E1E2E3蔗糖酶米氏常数的测定反响物活力测定数据处理0.1mpH4.0.1mpH4.管ol/L6号蔗糖buff液er酶液 l/Lml NaO000022l)0.50.5)31.50010.41.620.50.531.50.1730.011005.7820.51.520.50.531.50.2810.0125803.5630.61.420.50.531.50.3200.01566

39、.73.1240.81.220.50.531.50.3820.02502.6251120.50.531.50.4490.025402.2361.50.520.50.531.50.6060.037526.71.6572020.50.531.50.7060.05201.42物(ml)DNS试水剂(ml)A540度(S)1/S1/AX-4.818，即-1/Km=-4.818,故：Km=0.20760.23581/Vmax=0.2358，故：Vmax=4.24124 30 页吉林大学国家级生物试验教学示范中心试验报告姓名：周秀丽课程：生物化学试验题目：啤酒酵母蔗糖酶提取、分别纯化、性质鉴定及反响动力学

40、试验 学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：列号123试验结果试管号A:温度B:pHC:浓度列号123试验结果试管号A:温度B:pHC:浓度Yi：A5401402.60.050.8772404.60.11.0643406.60.150.8494502.60.10.6745504.60.150.6986506.60.050.6717602.60.150.0178604.60.051.2299606.60.10.016K12.7901.5682.777K22.0432.9911.754K31.2621.5361.564k10.9300.5230.

41、9266.095k20.6810.9970.585k30.4210.5120.521R0.5090.4850.405A 因素列B 因素列C 因素列K1y+ y+ y =2.790y+ y + y =1.568y+ y+ y =2.77712311K2y+ y + y=2.043y + y + y =2.991y + y+ y=1.754K3y+ y + y=1.262y + y + y =1.536y + y+ y=1.564k1K1=0.930K1 =0.523K1=0.926k2K2=0.681K2=0.997K2=0.585k3K3=0.421K3=0.512K3=0.521Rkmax.

42、-kmin.=0.509kmax.-kmin.=0.485T=Yi= y+ y+ y+ y + y + y + y + y + y=6.095123由以上数据，R=0.509 R=0.485 R=0.405，影响大，则该因素的不同水平对应的平均转化率之ABC间差异大，因素对试验结果的影响就大，故：因素的主次排序为：A 温度B PHC 浓度。K1、K2、K3、k1、k2、k3 的值，指标越大越好，应中选取最大的水平，从表可知，本试验应中选取每个因素中k1k2k3 40PH=4.60.05mol/L。25 30 页吉林大学国家级生物试验教学示范中心试验报告姓名：周秀丽课程：生物化学试验题目：啤酒酵

43、母蔗糖酶提取、分别纯化、性质鉴定及反响动力学试验 学号：45110709 时间：2022/5/24-27温度：湿度：地点：C462教师签字：C由上述数据k PH 值和浓度，由RA 0.509、RB 0.485、R 0.405 可知，相较缓冲液浓度来说，温度和PH 值对酶活力影响更大一些，在本C试验中蔗糖酶在PH4.6 而稍偏酸性条件下活力更强一些，由表中图像可直观看到各因素对酶活性的40、PH=4.50.05mol/L左右时条件最适。26 30 页吉林大学国家级生物试验教学示范中心试验报告姓名：周秀丽学号：45110709课程：生物化学试验时间：2022/5/24-27吉林大学国家级生物试验教

44、学示范中心试验报告姓名：周秀丽学号：45110709课程：生物化学试验时间：2022/5/24-27题目：啤酒酵母蔗糖酶提取、分别纯化、性质鉴定及反响动力学试验温度：湿度：地点：C462教师签字：第 第 27 30 页五、现象分析1、在酶制备过程中离心后取出离心管后分三层 下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态和 密度有关，并且又与重力场的强度及液体的粘度有关。象红血球大小的颗粒，直径为数微米，就可 以在通常重力作用下观看到它们的沉降过程。此外，物质在介质中沉降时还伴随有集中现象。集中 是无条件确实定的。集中与物质的质量成反比，颗粒越小集中越严峻。

45、而沉降是相对的，有条件的， 要受到外力才能运动。沉降与物体重量成正比，颗粒越大沉降越快。对小于几微米的微粒如病毒或 蛋白质等，它们在溶液中成胶体或半胶体状态，仅仅利用重力是不行能观看到沉降过程的。由于颗 粒越小沉降越慢，而集中现象则越严峻。离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗 粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分别开。产生下层透亮，中间为蛋白层， 上层为有机层。2Folin-乙试剂后溶液呈蓝色。凡含有两个及两个以上肽键 (-CO-NH-) 的化合物在碱性溶液中 (Folin-甲试剂) 都能与 Cu2+ 作用，形成紫色的复合物；全部的蛋白质均可与 Folin-甲试剂

46、反响形成紫色的铜-蛋白质复合物；铜-蛋白质复合物在 pH=10 的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸 (Folin-乙试剂) 复原成兰色的钼蓝和钨(在肯定范围内)与蛋白质的含量成正比。3、参加3,5-二硝基水杨酸后，血糖管中的液体呈黄色3,5二硝基水杨酸的颜色热后，血糖管内液体颜色呈棕红色。复原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物3,5二硝基水杨酸则被复原为棕红色的3氨基-5-硝基水杨酸。在肯定范围内，复原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系。 4E3收集E3 17 7-17、17-13 10ml。 紫外检测仪工作原理的依据是光吸取定律。从光源发出的光经狭缝、滤光片、样品池到光电培增管上，使束

47、由于样品浓度不同所引起光强的变化转换成光电流的变化，此光电流经放大器输入到对 T A A=1g =CL 式中为待测样品的克分子消光系统，C为样品浓度，承受克分子/升单位，L 为光程，用厘米作单位。依据上式就知测出了A，就知样品浓度 C。假设从放大器直接输入记录仪，绘出的是样品透光率T 变化的图谱，假设从对数转换器输入到记录仪绘出的是样品光密度A 变化的图谱。故，尖峰处的酶活力最大。六、思考题：1、指出有机溶剂分级沉淀法原理及操作中的留意事项？原理：有机溶剂对很多能溶于水的小分子生化物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子都能发生沉淀作用。多糖类的水溶液参加等量或倍量的乙醇或用丙酮和甲醇代替多糖颗粒的水化膜及降低溶液的电解常数，使多糖沉淀而析出。不同溶质的沉淀要求不同浓 度的有机溶剂，是有机溶剂分步沉淀的理论根底。留意事项：1、溶剂选择常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺、二甲基亚砜也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。2、温度使用有机溶剂沉淀生物大分子时应把握在低温下进展。3、样品浓度的把握一般认为蛋白质的初始浓度为 0.5-2% 为好。2、如何将本试验的酶活力单位换算成国际单位？1 IU= 16.6710-9 kat国际单位I：在特定的条件下