大豆异黄酮生产工艺优化

1、 PAGE IIUltrasonic assists optimization of extraction of SoyIsoflavonesBio-engineering Major ZHANG QingAbstract: In this paper, we extract soy isoflavones from soybean powder ,Through the optimized extraction process conditions , Soybean isoflavone extraction increased significantly. By using a sing

2、le factor experiment research on extracting solvent, solvent concentration, extraction temperature, extraction time, solid to liquid ratio, extraction times, ultrasonic power and sonication time and processing conditions on the extraction yield of soybean isoflavones, and optimized by orthogonal ext

3、raction process, significantly improve the extraction rate of soybean isoflavones. Experimental results show the optimum parameters: 60% ethanol concentration, temperature 50 , time 0.5h, solid to liquid ratio of 1:20. the most extraction of soy isoflavones is 0.4126%；Acid hydrolysis method all fact

4、ors on the influence of soybean isoflavone extraction order degrees are Acid solution concentration , extraction temperature, extraction time, experimental results show the optimum parameters: concentration3mol/L、temperature 70、time 50min。the most extraction of soy isoflavones is 0.2138%。Key words:

5、Soybean meal；Soy Isoflavones； Extraction conditions 目 录 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc292727060 1绪论1 HYPERLINK l _Toc292727061 1.1 大豆异黄酮的来源 PAGEREF _Toc292727061 h 1 HYPERLINK l _Toc292727062 1.2 大豆异黄酮的组成结构与理化性质 PAGEREF _Toc292727062 h 1 HYPERLINK l _Toc292727063 1.2.1 大豆异黄酮的组成结构 PAGEREF _Toc29272

6、7063 h 1 HYPERLINK l _Toc292727064 1.2.2 大豆异黄酮的理化性质 PAGEREF _Toc292727064 h 2 HYPERLINK l _Toc292727065 1.3 大豆异黄酮的生物活性 PAGEREF _Toc292727065 h 3 HYPERLINK l _Toc292727066 1.3.1大豆异黄酮的雌激素样作用 PAGEREF _Toc292727066 h 3 HYPERLINK l _Toc292727067 1.3.2 大豆异黄酮的抗癌作用 PAGEREF _Toc292727067 h 3 HYPERLINK l _Toc

7、292727068 1.3.3 大豆异黄酮对心血管疾病的防治作用 PAGEREF _Toc292727068 h 4 HYPERLINK l _Toc292727069 1.3.4 大豆异黄酮抗老年痴呆作用 PAGEREF _Toc292727069 h 4 HYPERLINK l _Toc292727070 1.3.5 大豆异黄酮对动物生长的调节作用 PAGEREF _Toc292727070 h 5 HYPERLINK l _Toc292727071 1.3.6 大豆异黄酮能提高动物的产蛋率及泌乳功能 PAGEREF _Toc292727071 h 6 HYPERLINK l _Toc29

8、2727072 1.4 大豆异黄酮的国内外研究现状与展望 PAGEREF _Toc292727072 h 6 HYPERLINK l _Toc292727073 1.5 大豆异黄酮的提取 PAGEREF _Toc292727073 h 7 HYPERLINK l _Toc292727074 1.5.1 有机溶剂提取法 PAGEREF _Toc292727074 h 7 HYPERLINK l _Toc292727075 1.5.2 水解提取法 PAGEREF _Toc292727075 h 8 HYPERLINK l _Toc292727076 1.5.3 超声波提取法 PAGEREF _To

9、c292727076 h 8 HYPERLINK l _Toc292727077 1.5.4 微波萃取法 PAGEREF _Toc292727077 h 8 HYPERLINK l _Toc292727078 1.5.5 超临界萃取法 PAGEREF _Toc292727078 h 9 HYPERLINK l _Toc292727079 1.6 本论文研究的内容、目的和意义 PAGEREF _Toc292727079 h 9 HYPERLINK l _Toc292727080 2.大豆异黄酮提取工艺的研究 PAGEREF _Toc292727080 h 10 HYPERLINK l _Toc2

10、92727081 2.1 材料和仪器 PAGEREF _Toc292727081 h 10 HYPERLINK l _Toc292727082 2.1.1 材料 PAGEREF _Toc292727082 h 10 HYPERLINK l _Toc292727083 2.1.2试剂 PAGEREF _Toc292727083 h 10 HYPERLINK l _Toc292727084 2.1.3 仪器 PAGEREF _Toc292727084 h 10 HYPERLINK l _Toc292727085 2.2 方法 PAGEREF _Toc292727085 h 10 HYPERLINK

11、 l _Toc292727086 2.2.1 原料的预处理 PAGEREF _Toc292727086 h 10 HYPERLINK l _Toc292727087 2.2.2 大豆异黄酮的提取 PAGEREF _Toc292727087 h 10 HYPERLINK l _Toc292727088 2.2.3 大豆异黄酮的测定 PAGEREF _Toc292727088 h 10 HYPERLINK l _Toc292727089 2.3实验方案 PAGEREF _Toc292727089 h 11 HYPERLINK l _Toc292727090 2.3.1有机溶剂提取单因素实验方案 P

12、AGEREF _Toc292727090 h 11 HYPERLINK l _Toc292727091 2.3.2有机溶剂提取正交实验方案 PAGEREF _Toc292727091 h 12 HYPERLINK l _Toc292727092 2.3.4酸水解法正交实验方案 PAGEREF _Toc292727092 h 13 HYPERLINK l _Toc292727094 2.4. 结果与分析 PAGEREF _Toc292727094 h 14 HYPERLINK l _Toc292727095 2.4.1 有机溶剂提取单因素实验 PAGEREF _Toc292727095 h 14

13、 HYPERLINK l _Toc292727096 2.4.2 有机溶剂提取正交实验 PAGEREF _Toc292727096 h 20 HYPERLINK l _Toc292727097 2.4.3 酸水解法提取正交实验 PAGEREF _Toc292727097 h 22 HYPERLINK l _Toc292727098 3.结论 PAGEREF _Toc292727098 h 24 HYPERLINK l _Toc292727099 3.1有机溶剂提取单因素实验结论 PAGEREF _Toc292727099 h 24 HYPERLINK l _Toc292727100 3.2有机

14、溶剂提取正交实验结论 PAGEREF _Toc292727100 h 24 HYPERLINK l _Toc292727101 3.3酸水解法提取正交实验结论 PAGEREF _Toc292727101 h 24 HYPERLINK l _Toc292727102 结束语 PAGEREF _Toc292727102 h 25 HYPERLINK l _Toc292727103 参考文献 PAGEREF _Toc292727103 h 26 HYPERLINK l _Toc292727104 致谢 PAGEREF _Toc292727104 h 281绪论大豆又名黄豆，是世界上许多国家和地区的主

15、要食品品种之一，是人类的重要食品资源【1】。作为一种功能性食品，公元前2800多年前的神农本草经首次记载了大豆的药用价值【2】。近年来，免疫学、动物体内及体外实验等研究及流行病学调查结果表明，大豆中含有丰富的异黄酮，大豆异黄酮是一类从大豆种中提取的植物雌激素类物质，主要包括染料木黄酮，大豆黄酮和黄豆黄素，大豆异黄酮是大豆的主要活性物质，对人体生理病理产生广泛影响。自然界中异黄酮资源十分有限，大豆是唯一含有异黄酮且在营养学上有意义的植物【3-4】。大豆异黄酮的开发引起了国内外的广泛关注。1.1 大豆异黄酮的来源 异黄酮在自然界中的分布只局限于豆科的蝶形花亚科等极少数植物中，如大豆、墨西哥小白豆、

16、苜蓿和绿豆等植物中，其中异黄酮含量最高的只有苜蓿和大豆，一般苜蓿中异黄酮的含量为0.5%3.5%，大豆中异黄酮含量为0.1%0.5%。 大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次生代谢产物，是生物黄酮中的一种，也是一种植物雌激素。它主要分布于大豆种子的子叶和胚轴中，种皮中含量极少。80%90%的异黄酮存在于子叶中，浓度为0.1%0.3%。胚轴中所含异黄酮种类较多且浓度较高，为1%2%，但由于胚只占种子总重量的2%，因此尽管浓度很高，所占比例却很少（10%20%）。1.2 大豆异黄酮的组成结构与理化性质1.2.1 大豆异黄酮的组成结构大豆中天然存在的大豆异黄酮共有12种，可以分为3类，即黄豆苷类(Dai

17、dzni Gruops)、染料木苷类(Genistin Groups)、大豆黄素苷类(Glycitin Groups)，以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型等4种形式存在【5】，研究者利用紫外光谱、质谱、核磁共振谱等方法分析确定了这些组分的结构(见图1、图2)。 图1 大豆异黄酮苷元化学结构式图2 大豆异黄酮葡萄糖苷化学结构式经研究证实，12种大豆异黄酮中只有游离形式的异黄酮(Gne和Dai)具有较高的生物活性，能有效地预防和抑制骨质疏松、子宫癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌和前列腺癌等多种疾病的发生分生，但这种形式的异黄酮的含量只占大豆异黄酮总量的很少一部分【6】。1.2.2

18、大豆异黄酮的理化性质纯大豆异黄酮是无色有苦涩味的晶状物质，大豆异黄酮易溶于丙酮、乙醇、甲醇、乙酸乙酯等极性溶剂中。在水溶性上，与大豆异黄酮的结构有关，游离型式的葡萄糖苷配基(galucnoe)水溶性最差，基本不溶于水，葡萄糖苷(glucoside)和丙二酰基配糖体或乙酰配糖体(conjugated glucoside)一般则易溶于水，但glucoside中的genistin在水中的溶解度与温度有关，水中的溶解度在4一50之间没有明显变化，在7090其溶解度随温度的升高而显著增加。因此，用水溶液提取大豆异黄酮，温度应超过70。显色反应：大豆异黄酮的颜色反应多与分子中的酚羟基及Y一毗喃酮环有关与某

19、些化学物质反应，呈现特殊的颜色，可作为鉴别大豆异黄酮的定性反应。(l)钠汞齐还原反应 向含有大豆异黄酮乙醇溶液中加入钠汞齐实剂，放置4h后过滤，滤液用lmol/L的盐酸化，溶液显红色。(2)锆盐一枸酸显色 加入2%二氯氧错的甲醇溶液到样品中的甲醇溶液中，染料木黄酮及染料木苷出现黄色，在加入2%构酸的甲醇溶液，黄色减退，加水稀释后转为无色。(3)硫酸一茴香醛显色将大豆异黄酮溶液加入到硫酸一茴香醛溶液中，染料木苷显深褐色，大豆苷显深蓝色，染料木黄酮显桔黄色，大豆苷元不显色。(4)醋酸镁显色喷以1%的醋酸镁甲醇溶液，通过纸斑反应，大豆异黄酮呈褐色，且在紫外光下产生荧光【6】。1.3 大豆异黄酮的生物

20、活性1.3.1大豆异黄酮的雌激素样作用 异黄酮与雌二醇有相似性，都具有雌激素的活性基团二羟基酚。通过与雌激素受体（ER）结合发挥微弱激素效应，异黄酮对雌激素也表现颉颃作用，由于与雌二醇竞争结合ER，使得雌二醇不能产生激素效应，进而对和激素相关的疾病具有保护作用。与雌激素相似的结构特点使异黄酮能够与ER结合，从而表现出雌激素活性和抗雌激素活性，即体内雌激素含量低时，表现为雌激素活性，而在体内雌激素含量过高时，表现为抗雌激素作用【7-8】。有助于使机体内雌激素水平维持在一个平衡和安全状态，这种关系可缓解更年期综合症。临床研究表明，日本女性饮食中含有较多的大豆异黄酮，更年期综合症的发病率仅为欧美国家

21、的25%。李潮【9】等通过用去卵巢大鼠模型模拟绝经期妇女雌激素水平下降，生殖器萎缩的现象，并给该模型灌喂大豆黄酮悬浮液，结果发现经大豆黄酮治疗后，子宫较去卵巢组有所增大，腺体增多，且两种雌激素受体ER和ER在子宫内的表达,均与去卵巢组有明显差异而与雌激素组差异不大。该实验结果显示，大豆黄酮能增加去卵巢大鼠的子宫重量，改善其萎缩情况，但程度弱于雌激素，表明大豆黄酮有一定的雌激素活。1.3.2 大豆异黄酮的抗癌作用 研究发现,大豆异黄酮在肿瘤的发育过程中能有效延缓或阻止肿瘤细胞变成癌细胞。这是因为其可以抑制癌细胞血管的新生和癌前期细胞的DNA合成过程，从而阻止癌细胞的发育。20世纪80年代以来，流

22、行病学调查发现与激素代谢密切相关的肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌等的发病率同大豆制品的摄入量呈负相关。 有文献报道大豆异黄酮对人胃癌细胞SGC-7901 有抑制作用,抑制作用与诱导胃癌细胞凋亡、阻抑细胞周期进程有关，诱导胃癌细胞凋亡、阻抑细胞周期进程是大豆异黄酮抗胃癌作用的机制之一【10】据报道,欧美国家该类肿瘤的发生率比中国、日本等豆制品摄入量较多的国家高出约4倍.对居住夏威夷日裔20年跟踪调查，发现几乎不食大豆食品男性比每日食大豆制品男性患前列腺癌的危险性高出3倍。1990年，美国癌症研究所确认大豆中含有5种具有抗癌活性的成分，它分别是为植物菌醇、肌醇六磷酸、大豆皂苷、胰蛋白酶抑制素和大

23、豆异黄酮。因此可以用于治疗乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、子宫内膜癌和白血病等。由于豆异黄酮有弱雌激素作用，而有文献报道长期服用雌激素会导致乳腺癌和子宫内膜癌的发生，所以大豆异黄酮在抗癌与致癌方面还存在争议，也不排除高剂量会致癌的可能，目前对其的使用剂量和抗癌作用还有待进一步研究。 大豆异黄酮抗癌的主要作用机制包括以下几个方面：类似雌激素作用以及抗激素作用。大豆异黄酮可以与体内的雌激素竞争雌激素受体，从而使体内的雌激素水平稳定在一个平衡状态，还可以刺激性激素结合球蛋白合成，减少性激素的生物活性。抑制酪氨酸蛋白激酶(PTK)和拓扑异构酶(To-Po)的活性.PTK 是多种生长因子的受体,参与细胞

24、有丝分裂的信号转导,而染料木黄酮是PTK的抑制剂，影响细胞促有丝分裂的信号转导，最终抑制癌细胞分裂达到抗癌作用To-Po与DNA的转录、复制有关，染料木黄酮可能通过抑制纯化的To-Po的解链活性，也使完整细胞内与蛋白质结合的DNA 链断裂，从而使生长抑制或细胞死亡。在癌细胞增殖阶段，抑制新生血管形成作用。肿瘤组织的生长需要有新生血管提供充足的血液，大豆异黄酮能有效的抑制肿瘤组织中血管新生，从而阻断对其所需营养物质的供给。抗氧化作用。活性氧自由基常引起细胞内DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的氧化损伤，导致细胞癌变。染料木黄酮和大豆苷元均能明显抑制Fe2+- AOP-NADPH 系统引发的大鼠肝

25、微粒体脂过氧化的形成和黄嘌吟/黄嘌呤氧化酶系统引发的氧自由基的产生。大豆异黄酮对脂质过氧化体系中的脂质自由基有明显的清除作用，从而可有效的抑制氧化级联反应，达到抗癌的目的。调节细胞周期，诱导癌细胞的凋亡。大豆异黄酮对体外培养细胞的细胞周期有干扰作用，它可使白血病细胞周期阻滞在G1期、G2 期、G2/M 期或S期。浓度不同，作用不同并能引起细胞凋亡。1.3.3 大豆异黄酮对心血管疾病的防治作用 植物雌激素在预防心血管疾病方面有一定作用。Anthony MS等【11】证实大豆对心血管有防护作用,其中的乙醇提取物中具有抗动脉硬化的活性,后经进一步的研究证明是其中的异黄酮发挥活性作用,因此大豆异黄酮作

26、为一种潜在的植物化学成分的预防、治疗作用已引起人们的普遍关注，同时也开始了对大豆异黄酮预防动脉硬化发生机理的研究。近20年，研究者对大豆异黄酮在心血管疾病中的作用机制进行了大量研究。大多数学者认为其机制是多元性的，目前较成熟的观点有以下几种【12】：LDL(低密度蛋白)受体调节。大豆异黄酮可正向调节LDL受体，增加其活性。从而促进胆固醇的清除。抗氧化特性。大豆异黄酮具有降低LDL颗粒体积和防止LDL过度氧化作用，异黄酮通过这种作用可降低LDL颗粒在冠状动脉壁上的沉积，从而减少粥样硬化的发生率。抑制血管平滑肌细胞的增殖。染料木黄酮可降低基地纤维生长因子（FGF）以及纤维蛋白溶酶原激活因子的活性，

27、从而抑制平滑肌细胞增殖。抗血栓形成作用。酪氨酸蛋白磷酸化与血小板活性密切相关，染料木黄酮通过对酪氨酸激酶的抑制作用降低血小板内酪氨酸蛋白磷酸化，进而导致血小板活性降低，使其在血管上聚积减少，阻止粥样硬化的发生。1.3.4 大豆异黄酮抗老年痴呆作用 2003年有报道，大豆异黄酮有脑保健作用，与人类非常接近的灵长类动物恒河猴若长期摄食大豆，极少发生阿尔茨海默病（老年痴呆症），而对照组发病率较高，与西方人相似，这与西方人日常饮食中较少食用大豆类制品有关。 美国科学家把切除卵巢的老年雌猴分为2组，分别研究大豆异黄酮和内源性雌激素大脑的作用。研究发现，两组猴的大脑中与早老性痴呆有关的蛋白基本无变化，就说

28、明了大豆异黄酮和内源性雌激素一样，对大脑有益，并证明大脑是雌激素作用 的靶点。进一步研究发现，染料木黄酮可以亲和大脑中的ER亚型【13】 ,每天食用1mg异黄酮可有效预防早老性痴呆。从目前研究资料分析，某些脑部区域神经元的丢失，可能是衰老使神经系统某种功能减退的原因。近年来细胞凋亡与衰老关系的研究已成为热点，因为细胞凋亡与衰老过程中组织器官功能的退化与衰老等相关疾病的发生有密切关系。并且有迹象表明，细胞凋亡过盛可能是阿尔茨海默病等神经退行性疾病的原因。医学研究表明【14】，胆碱能神经在人类认知和记忆过程中的作用非常重要，阿尔茨海默病与胆碱乙酰转移酶(chAT) 的活性和胆碱能神经减少密切相关。

29、此类患者用大豆异黄酮进行治疗，可明显降低该病的发病率，缓解症状，恢复认知。目前市场上已有大豆异黄酮软胶囊出售，主要针对上述一些疾病进行治疗。1.3.5 大豆异黄酮对动物生长的调节作用大豆异黄酮适量添加到家畜的日粮中可提高生长性能，大豆异黄酮对动物的增重作用表现性别差异，能显著增加雄性动物和公鸡的增重及饲料利用率，促进蛋白沉积和肌肉发育，而对去势雄性动物和雌性动物则影响不大。实验证实【15】，雄性肉鸡饲喂大豆异黄酮后，鸡冠生长加速，日增重提高，胸肌和腿肌重分别提高6.5%和7.26%，饲料利用率明显提高，蛋白质利用率显著提高，但对雌性肉鸡则无明显作用。分析表明公鸡睾酮、-内啡肽、生长激素，胰岛素

30、样生长因子-1（IGF）,T3,T4 和胰岛素水平明显提高。对雄性高邮鸭实验【16】也获得类似结果，日增重提高16.92%，饲料利用率提高7.26%。公猪日粮中添加500mg/kg 的大豆黄酮,可使血清中总生长激素水平上升37.52%，代谢产物尿素氮、胆固醇浓度明显下降。在35日龄仔猪的日粮中添加大豆黄酮，仔公猪体重显著增加，但仔母猪与对照组差异不显著【17】。Payne R L等【18】研究了大豆异黄酮对生长后期猪生长性能、肉品质及胴体性状的影响。结果表明，大豆异黄酮添加组能够提高猪的日增重，并降低猪脂肪含量，提高猪瘦肉率。大豆异黄酮还可以直接影响瘤胃微生物的主要消化酶活性，总挥发性脂肪酸水

31、平，改善消化功能，提高反刍动物的生长和生产能力。出现大豆异黄酮对公畜生长促进而对母畜无大影响的原因可能是公畜体内的雌激素含量较少，使用了大豆异黄酮后，雌激素效应明显，能够促进生长激素的分泌。相反，母畜的体内雌激素较多，由于竞争性抑制外加大豆异黄酮的弱雌激素作用，所以对生长激素的分泌影响不大。大豆异黄酮通过影响神经-内分泌系统的性腺轴和生长轴，促进睾酮、生长激素和IGF-1的生成和释放,从而促进动物的生长,其可能作用机理为：它直接作用于肌肉细胞的雌激素受体，使肌细胞增大，促进肌肉蛋白质的积累；促进肝脏蛋白质合成，使血浆蛋白水平发生变化，血清白蛋白、球蛋白和纤维蛋白的含量升高；通过与下丘脑、垂体等

32、雌二醇受体结合，降低生长抑素水平，从而提高生长激素（GH）水平和(IGF-1)水平,促进动物生长；异黄酮植物雌激素在下丘脑与雌二醇竞争性结合雌二醇受体，发挥抗雌激素作用，削弱了雌二醇的负反馈调节，引起内源性睾酮的增加，促进了雄性动物蛋白质合成。1.3.6 大豆异黄酮能提高动物的产蛋率及泌乳功能大豆异黄酮有弱雌激素样作用，因此对产蛋也有一定的影响。产蛋后期适量的大豆黄酮可延长产蛋期，提高产蛋率、蛋重和饲料转化率。实验表明【19】，12月龄蛋用鹌鹑日粮中添加6mg/kg大豆黄酮,鹌鹑的产蛋率提高10.3%(P0.01),在产蛋后期绍兴蛋鸭日粮中加入3mg/kg的大豆黄酮,产蛋率提高13.13%,饲

33、料转化率提高9.40%。分子生物学研究证明，大豆异黄酮能明显促进家禽GH基因的表达，提高GH含量，从而促进繁殖。朱建平等【20】将56周龄的樱桃谷肉种鸭分为3组，分别在饲料中添加2.4mg 和6mg大豆黄酮进行实验,实验结果显示,3个实验组产蛋率比对照组分别增加3.1%,4.17%,5.56% (P0.05),说明大豆黄酮对产蛋率有明显的影响。但该作用是否与大豆异黄酮的添加量成正比还有待进一步研究。 大豆异黄酮提高泌乳功能具体表现为：可以直接作用于乳腺的雌二醇受体，表现为雌激素样效应；增加乳腺细胞的雌、孕激素受体数目和亲和力；作用于下丘脑和垂体，促进垂体GH和催乳素PRL分泌，通过增加内源性G

34、H和PRL水平，发挥促进乳腺发育的作用；抑制或颉颃多巴胺对泌乳及垂体GH和PRL分泌来提高泌乳性能。对妊娠后期母猪饲喂异黄酮能提高胰岛素生长因子水平，使乳腺血流量增加，并刺激乳腺上皮细胞分化成分泌细胞，从而使乳汁分泌增加。也有报道用适量的植物雌激素饲喂奶牛，能使每头实验奶牛日产奶量平均增加1.5kg,整个泌乳期增加100kg【21】。1.4 大豆异黄酮的国内外研究现状与展望1986年美国一学者在做大豆胚芽制品中发现了大豆异黄酮，并对其进行了全面的分析。1990年，美国国家癌症研究所ACI(American Cancer Institute)根据它的功能作用，邀请有关专家对其抗癌效果进行研讨，结

35、果表明：大豆异黄酮是较佳抗癌防癌物质，在医药界引起较大轰动，还被列为大豆精深加工和医药产品重点开发项目。与此同时，日本科学家在对乳腺癌及前列腺癌的治疗中，也成功地使用了异黄酮，并说明每天食用20g-30g大豆，就可获得充足的大豆异黄酮而确保健康。而国内外对大豆精深加工所采取的9种高新技术，适于异黄酮加工的就有6种：即保持制品活性的超临界CO2萃取技术；控制产品分子释放挥发的微囊技术；增加提取比例的超微粉碎技术；提高制品溶合性的膜分离技术；避免制品劣变的高压处理技术；增强干燥、杀菌和除异味的微波干燥技术。萃取介质国内多采用甲醇和乙醇，国外也有病痛，乙酸乙酯，乙酰和氯。 我国是大豆的故乡，目前大豆

36、的产量排在美国、巴西和阿根廷之后 ，居世界第四。据国家大豆工程技术中心统计，中国当前初具规模的大豆加工企业共有四千三百家， 其中一半以上是榨油企业。随着国家对大豆深加工项目的重视，作为大豆深加工内容之一的大豆异黄酮产品市场逐渐升温。尽管我国学者已开始注意到大豆异黄酮产品研开发的重要性,但总的说来,开发层次低,异黄酮含量低,提取精制技术落后。目前我国市场上由国内企业生产的大豆异黄酮保健食品还不多，一些涉足大豆异黄酮产品生产的企业 主要是从事天然产物的研究和开发，他们所提供的大豆异黄酮主要用作医药中间体。现在,我国大约有十余进行大豆异黄酮生产的厂家,但极少有特色产品推向市场,主要向日本、美国及欧洲

37、出口低含量的大豆异黄酮粗品。日本已开发出一系列浓度的大豆异黄酮产品,尤以最近研制出的”富士黄酮”大豆异黄酮系列制品为代表。该产品具有独特的优点:水溶性高,热稳定性高,无苦涩味,已广泛应用于药品、保健品、食品及饮料行业。美国的ADM公司于2000年在美国率先推出了含量为40%的大豆异黄酮制品。在2001年美国植物制剂销售市场上,大豆异黄酮类产品的销售额排名第九。据专家预测,在以后几年,其销售额排名将更靠前。而我国的大豆资源十分丰富，大豆异黄酮类植物雌激素有着广泛的应用前景，开发应用后会带来更多的经济效应。1.5 大豆异黄酮的提取目前从豆制品等天然产物中提取大豆异黄酮一般是采用甲醇或乙醇浸提，然后

38、用石油醚或正己烷脱脂，丙酮、无水乙醚萃取获得粗提物。采用这些传统方法提取大豆异黄酮，虽然可操作性较强，但存在的问题很多，如实验步骤较为繁琐、溶剂提取率低、结合型大豆异黄酮不稳定、不利于大豆异黄酮的定量分析、大豆异黄酮得率较低等，因此有必要对传统方法加以改进，主要从增加得率、提高产物纯度、简化操作步骤等方面对大豆异黄酮的提取技术做一些研究。1.5.1 有机溶剂提取法大豆异黄酮提取所采用的溶剂有乙醇水溶液、丙酮酸溶液和弱碱性水溶液。最常用的是乙醇水溶液,其次为弱碱性水溶液。对于乙醇溶剂90% 95%高浓度的醇适于提取苷元,而60%浓度的醇适于提取苷类。在碱性稀醇或碱性水提取时,所用碱的浓度不宜过高

39、,以免在强碱条件下加热破坏异黄酮化合物的母核结构。1.5.2 水解提取法采用水解法是将结合型大豆异黄酮水解为游离型大豆异黄酮，这样既有利于分离纯化，也有利于大豆异黄酮的检测。汪海波等以脱脂大豆粕为原料，采用酸水解后用无水乙醚萃取的方法提取游离型大豆异黄酮成分。实验结果表明，酸水解大豆异黄酮的提取率和产品纯度均高于常规有机溶剂浸提法；张炳文等通过正交实验确立了糖苷型大豆异黄酮转化为游离型大豆异黄酮的最佳酸水解工艺条件：盐酸甲醇溶液的浓度为2mol/L,水解温度为80，水解时间为60 min，水解前后大豆素的含量由0.22%增加至14.01%，染料木素的含量由0.02%增加至23.45%。Ligg

40、ins等利用曲霉中产生的水解酶将大豆粉中的结合型大豆异黄酮水解为游离型大豆异黄酮，再用乙酸乙酯萃取后，经衍生化反应后，气相色谱质谱联用进行定量，该法不仅效率高，也有利于大豆异黄酮的定量。1.5.3 超声波提取法超声波提取技术的原理是根据超声波具有空化、粉碎、搅拌等特殊作用，对植物药材的细胞有破坏现象，使其有效成分快速溶于溶媒之中，以利于提取。谢明杰等利用超声提取大豆异黄酮，并与加热回流的提取方法进行了比较。结果表明：超声提取30min所得大豆异黄酮的提取率比加热回流提取120 min的提取率高约46%，这说明超声提取具有省时、节能、提取率高的优点。潘廖明等比较了醇提法与超声及超声加搅拌辅助提取

41、大豆异黄酮的效果。正交实验结果显示：当超声频率为25 kHz、超声功率为160 W、60超声处理60 min时，大豆异黄酮的得率和含量分别可达4.23 mg/g和2.74%，与醇提法相比分别提高了3.93%和7.87%；采用相同条件下的超声加搅拌（300 r/min）处理，大豆异黄酮得率可达4. 36 mg/g，与单纯超声辅助提取法相比提高了3.07%。AIIaoua等采用溶剂提取法、连续提取和超声提取测定两种大豆产品中大豆异黄酮的含量，结果显示：连续提取可以使大豆异黄酮的含量提高，采用超声提取比溶剂连续提取5次得到更多的大豆异黄酮。Mauricio等比较了混合搅拌与超声提取大豆异黄酮的效能。

42、在提取溶剂、温度、时间相同的条件下，超声提取糖苷型大豆异黄酮时均比混合搅拌提取具有更高的提取率。以上都说明了超声提取大豆异黄酮具有快速、高效、操作方便的优点。1.5.4 微波萃取法微波萃取技术是根据物质在微波场中吸收能力差异，使基体物质的某些区域被选择性加热，从而使被萃取物从基体体系中分离，进入微波吸收能力相对差的萃取剂中。张永忠等采用微波处理脱脂豆粕，微波处理4 min时，大豆异黄酮的溶出率显著增加，提取物的纯度也有所提高。Guo等使用微波辅助萃取葛根中大豆苷与大豆素等异黄酮成分，并考察了影响微波萃取的各种因素。结果表明，微波辅助萃取葛根中异黄酮成分仅需要1 min，方法简便易行，提取效率高

43、。1.5.5 超临界萃取法超临界流体萃取（SFE）技术是利用溶剂在超临界点附近某区域内，与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能，且对溶质的溶解能力随压力和温度的改变而在某范围内变动，而从多种液态或固态混合物中萃取出待分离组分的提取分离技术。应用CO2-SFE技术提取分离天然产物具有萃取速度快、效率高等特点，并且产品中没有有机溶剂残留，是一种环保、安全的新型技术。袁其朋等采用SFE-CO2法纯化大豆异黄酮，结果产物纯度达到90%以上，总回收率高于74%，远远优于传统的溶剂萃取法，且具有操作简单、不污染环境等优点，展现了较好的工业应用前景。Mauricio等用SFE对大豆异黄酮进行了提

44、取，在50、压力为360 bar和甲醇作改性剂的条件下，提取率最佳；与索氏提取和超声提取进行了比较，实验结果表明用SFE法将会得到更高纯度的目标产物，且操作更为简便。但SFE设备投资大，运行成本高，给应用带来了一定的难度。1.6 本论文研究的内容、目的和意义我国大豆资源极其丰富，但我国目前对大豆的利用主要限于食品加工及榨油，而对大豆异黄酮的提取、应用还不多。大豆在用于食用油加工中产生的副产品豆粕数量可观，这些豆粕除少部分用于发酵酱油、生产大豆浓缩蛋白或分离蛋白外，绝大多数被用作肥料和动物饲料，其富含的大豆异黄酮都未充分利用，造成了豆粕资源的极大浪费，也无疑是对极宝贵的分布十分有限的大豆异黄酮的

45、浪费。本实验就以豆粕为原材料，进行大豆异黄酮提取工艺的研究。我国对大豆异黄酮的研究起步较晚，效果也不甚理想。目前我国大豆异黄酮的提取方法有许多，如有机溶剂萃取法、超声波辅助法、酸解法、酶解法、大孔树脂吸附法、高速离心法、醇沉法、超临界萃取法等等,只是很多方法尚处于实验室阶段,不能够应用于工业化生产。我国大豆资源非常丰富,但异黄酮在大豆中含量一般为0.1%0.5%,为了有效提高异黄酮的提取效率,本实验采取工艺简单的有机溶剂提取法与酸水解法提取，采用有机溶剂从豆粕中提取大豆异黄酮，通过不同溶剂的选择、溶剂浓度、提取时间、提取温度、料液比以及提取次数的单因素实验和乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比

46、的正交实验就豆粕中大豆异黄酮提取的工艺条件进行优化，以确定了最佳工艺参数。采用酸水解法，通过酸溶液浓度、提取温度、提取时间的正交实验对豆粕中大豆异黄酮提取的工艺条件进行优化，以确定最佳工艺参数。为以豆粕为原料生产大豆异黄酮提供参考，为大豆的综合开发利用提供一定的参考依据，为工业化生产提供基础资料。2.大豆异黄酮提取工艺的研究2.1 材料和仪器2.1.1 材料脱脂豆粕（购于市场）2.1.2试剂甲醇，乙醇，正丁醇，乙酸乙酯2.1.3 仪器电热鼓风干燥箱 101A-2 海中光仪器表有限公司；高速万能粉碎机 FW-100 北京中兴伟业仪器有限公司；电子天平 BS110S 北京赛多利斯天平有限公司；恒温

47、振荡器 SHC-82 上海跃进医疗器械厂；台式离心机 TDL-40B 上海中光仪器表有限公司；紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司其它为本院实验室常规仪器、器皿。2.2 方法2.2.1 原料的预处理取脱脂豆粕经高速万能粉碎机粉碎后，过40目筛备用。2.2.2 大豆异黄酮的提取准确称取5g脱脂豆粕细粉置于250ml三角瓶中，按1：10的料液比加入50ml溶剂，用保鲜膜和橡皮筋封口，放入恒温振荡器，在50下提取2h，取出后以3500rmin的转速离心15min，取上清液，用提取溶剂定容至50ml备用。2.2.3 大豆异黄酮的测定(1) 标准曲线的绘制 准确称取10mg的染料木黄酮，用80%

48、乙醇（无水乙醇）溶解，定容至50ml容量瓶中，并摇匀。分别精确吸取0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml标准溶液至10ml容量瓶中，并用80%乙醇溶液（无水乙醇）定容，另以80%的乙醇溶液做空白对照。将配制好的标准溶液在262nm下测吸光度（A）【22】 。染料木黄酮标准液的实验浓度范围内与吸光度呈线性相关，可利用紫外分光光度计测其吸光度得到标准曲线及回归方程。(2) 样品中大豆异黄酮的测定取0.2ml样品液置于10ml容量瓶中，用其提取溶剂定容至10ml，并用相对应的提取溶剂做空白对照，在262nm下测吸光度，然后用吸光度按以下两个公式计算提取率。平行侧3次，并进行方差分

49、析。 Y=其中 Y吸光度A X由标准曲线计算得提取液异黄酮含量（g/ml）提取率（g/100g ）=X1050/0.2100/51062.3实验方案2.3.1有机溶剂提取单因素实验方案(1) 不同溶剂对提取率的影响分别准确称取5g脱脂豆粕细粉，按1：10的料液比加入50ml溶剂，用保鲜膜和橡皮筋封口，放入恒温振荡器，在50下提取2h，分别采用甲醇、80%乙醇、正丁醇、水、乙酸乙酯这5种不同的溶液为溶剂进行提取。离心后吸取滤液0.2ml定容至10ml，在紫外分光光度计下测其吸光度。(2) 不同溶剂浓度对提取率的影响分别准确称取5g脱脂豆粕细粉，分别用40%、50%、60%、70%、80%、90%

50、的乙醇溶液作为提取溶剂，按1：10的料液比，在50下提取2h。离心后吸取滤液0.2ml定容至10ml，在紫外分光光度计下测其吸光度。(3) 不同提取温度对提取率的影响 分别准确称取5g脱脂豆粕细粉，用最佳浓度的乙醇溶液作为提取溶剂，按1：10的料液比，分别在30、40、50、60、70、80下提取0.5h。离心后吸取滤液0.2ml定容至10ml，在紫外分光光度计下测其吸光度。(4) 不同提取时间对提取率的影响分别准确称取5g脱脂豆粕细粉，用最佳浓度的乙醇溶液作为提取溶剂，按1：10的料液比，分别在最佳温度下分别提取0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h。离心后吸取滤液0.2

51、ml定容至10ml，在紫外分光光度计下测其吸光度。(5) 不同料液比对提取率的影响分别准确称取5g脱脂豆粕细粉，用最佳浓度的乙醇溶液作为提取溶剂，分别按1：5、1：10、1：15、1:20、1：25的料液比，在最佳温度下按最佳提取时间提取。离心后吸取滤液0.2ml定容至10ml，在紫外分光光度计下测其吸光度。(6) 不同提取次数对提取率的影响分别准确称取5g脱脂豆粕细粉，用最佳浓度的乙醇溶液作为提取溶剂，按1：10的料液比，在最佳温度下按最佳提取时间提取。离心后将残渣再次按原条件提取1次，依此类推，分别提取1次、2次、3次、4次、5次、6次。离心后吸取滤液0.2ml定容至10ml，在紫外分光光

52、度计下测其吸光度。2.3.2有机溶剂提取正交实验方案有机溶剂提取的正交实验因素水平表见表1，选择L9(34)正交表安排正交实验见表2。 表1 有机溶剂提取的正交实验因素水平表 因素 乙醇浓度（%） 提取温度（） 提取时间（h） 料液比（g/ml）水平 A B C D1 60 50 0.5 1：102 70 60 1.0 1：153 80 70 1.5 1：20表2 有机溶剂提取的正交实验安排表因素 A乙醇浓度 B提取温度 C提取时间 D料液比 大豆异黄酮提取率实验号 （%） （） （h） （g/ml） （g/100g）1 1 1 1 1 2 2 2 1 3 3 3 2 1 2 3 2 2 3

53、1 2 3 1 2 3 1 3 2 3 2 1 3 3 3 2 1 2.3.4酸水解法正交实验方案酸水解法提取的正交实验因素水平表见表3，选择L9(34)正交表安排正交实验见表4。表3 酸水解法提取的正交实验因素水平表酸溶液浓度（mol/L） 提取时间（min） 提取温度（） 水平 A B C 1 1 50 70 2 2 60 80 3 3 70 90 表4 酸水解法提取的正交实验安排表实验号酸溶液浓度（mol/L）提取时间（min）提取温度（） 大豆异黄酮提取率ABCD（g/100g）1111121222313334212352231623127313283213933212.4. 结果与分

54、析2.4.1 有机溶剂提取单因素实验(1) 不同溶剂对提取率的影响分别准确称取5g脱脂豆粕细粉，按1：10的料液比加入50ml溶剂，用保鲜膜和橡皮筋封口，放入恒温振荡器，在50下提取2h，分别采用甲醇、80%乙醇、正丁醇、水、乙酸乙酯这5种不同的溶液为溶剂进行提取。(此组数据测定时吸取0.2ml定溶至10ml，以后各组数据测定吸取0.2ml定容至10ml。)测定吸光度，经计算的提取率结果见表5表5 不同溶剂对大豆异黄酮提取率的影响重复 甲醇 80%乙醇 正丁醇 水 乙酸乙酯 1 0.3289 0.3393 0.0237 0.4044 0.11712 0.3440 0.3388 0.0167 0

55、.4030 0.11813 0.3266 0.3336 0.0332 0.4247 0.1001平均值 0.3332 0.3372 0.0245 0.4107 0.1118注：提取率单位（g/100g）图4是不同提取溶剂下，大豆异黄酮提取量变化的关系图。从图中可以看出，提取溶剂对提取工艺有很大的影响。 由表5和图4的实验结果表明，水、乙醇和甲醇对提取率的影响最为显著，分别为0.4107%，0.3372%，0.3332%，但水提取会提取出蛋白质核酸等杂质，这些物质在紫外分光光度计下也能吸收紫外线影响测量结果，甲醇具有剧毒，考虑到乙醇影响显著且廉价易得，故应选用乙醇作为提取溶剂。(2) 不同溶剂浓

56、度对提取率的影响分别准确称取5g脱脂豆粕细粉，分别用40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液作为提取溶剂，按1：10的料液比，在50下提取2h。测定吸光度，经计算的提取率结果见表6表6 不同浓度对大豆异黄酮提取率的影响重复 40%乙醇 50%乙醇 60%乙醇 70%乙醇 80%乙醇 90%乙醇 1 0.3063 0.3105 0.3388 0.3473 0.3392 0.25112 0.2921 0.3000 0.3355 0.3506 0.3382 0.25113 0.2935 0.3039 0.3383 0.3544 0.3336 0.2657平均值 0.2973 0.30

57、47 0.3376 0.3508 0.3372 0.2560 注：提取率单位（g/100g）图5是不同乙醇浓度下，大豆异黄酮提取量变化的关系图。从图中可以看出，提取溶剂浓度对提取工艺有很大的影响，随乙醇浓度的升高提取率先升高后降低，呈现波浪式变化。 由表6和图5的实验结果表明，40%的乙醇提取出的溶液含杂质较多，影响大豆异黄酮的实际含量，70%的乙醇提取效果较好，提取率为0.3508%。(3) 不同提取温度对提取率的影响 分别准确称取5g脱脂豆粕细粉，用最佳浓度的乙醇溶液作为提取溶剂，按1：10的料液比，分别在30、40、50、60、70、80下提取0.5h。测定吸光度，经计算的提取率结果见表

58、7表7 不同提取温度对大豆异黄酮提取率的影响重复 30 40 50 60 70 80 1 0.3506 7.3236 0.3619 0.3681 0.3648 0.322320.3497 0.3832 0.3544 0.3869 0.3600 0.31203 0.3450 0.3662 0.3747 0.3926 0.3624 0.3148平均值 0.3484 0.3667 0.3637 0.3825 0.3624 0.3160注：提取率单位（g/100g） 图6是不同提取温度下，大豆异黄酮提取量变化的关系图。从图中可以看出，在相同的提取条件下，温度从30到60，提取液中大豆异黄酮的含量呈增加

59、趋势，60左右时达到最大，从70到80开始降低。因此，宜采用60作为提取温度。由表7和图6的实验结果表明， 60提取率较高，为0.3825%，可选用此温度进行提取。(4) 不同提取时间对提取率的影响分别准确称取5g脱脂豆粕细粉，用最佳浓度的乙醇溶液作为提取溶剂，按1：10的料液比，分别在最佳温度下分别提取0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h。测定吸光度，经计算的提取率结果见表8表8不同提取时间对大豆异黄酮提取率的影响重复 0.5h 1.0h 1.5h 2.0h 2.5h 3.0h 1 0.3610 0.3822 0.3728 0.3714 0.3652 0.354420.

60、3718 0.3846 0.3676 0.3671 0.3638 0.35493 0.3761 0.3850 0.3741 0.3638 0.3643 0.3346平均值 0.3696 0.3839 0.3715 0.3674 0.3645 0.3479注：提取率单位（g/100g）图7为不同提取时间下，大豆异黄酮提取率变化的曲线，在1h时，大豆异黄酮的提取率是最高的。由表8和图7的实验结果表明从0.5h到1h时，异黄酮的提取率呈增加趋势，从1h开始提取率缓慢下降，1h的提取率最高，为0.3839%，因此可选择1h为提取时间。(5) 不同料液比对提取率的影响分别准确称取5g脱脂豆粕细粉，用最佳