实时荧光定量PCR技术应用

1、实时荧光定量PCR技术应用1/61荧光定量PCR整体处理方案临床检测与诊断基因分型拷贝数变异研究稀有突变检测分子诊断基因治疗药物再生药物科学研究相对定量绝对定量基因表达溶解曲线分析microRNA蛋白表达研究质量与安全检测公共卫生食品安全检测动物健康法医应用亲子鉴定身份识别“Solutions Provider”提供处理方案2/61Real-Time PCR技术在QST领域应用提供四个方面应用和处理方案食品安全食源病菌快速检测GMO 定量原料起源分析，如动物源性成份检测动物健康动物和水生动物疾病快速检测公共卫生传染病快速筛查药品分析残留DNA定量支原体检测病毒快速检测3/61食品安全病原微生物

2、检测（细菌、病毒）4/61“食源性致病微生物”引发食品污染是食源性疾病发生主要原因，仅由“食源性致病微生物”引发疾病有就250种之多，在全世界造成了很多食品安全事件。国家卫生计生委截止经过突发公共卫生事件网络直报系统，共收到全国食物中毒类突发公共卫生事件汇报152起，中毒5559人，死亡109人。微生物引发食源性疾病，已成为我国食品安全头号杀手，一旦发生，对公众健康危害是明确而广泛。食品法典委员会(CAC)已将微生物性健康危害列为食源性危害三大原因之一。病原微生物细菌检测主要性5/611. Isolate DNA 2. Combine sample with MicroSEQ Assays 3

3、. Perform amplification on thermal cycler4. Analyze results using Real-Time PCR SofftwareAdd 100 L PrepMan Ultra reagent into tubeSuspend loopful of cells from plate or cultureBoil 100 C 10 min Vortex 20 sec， Centrifuge 2 min. Transfer supernatant to new tubeMicroSEQ Assays 30ul DNA sample QS 12K, V

4、iiA7, QS7, 7900HT, 7500, 7500 Fast, StepOne ,StepOnePlusReal-Time PCR SoftwareMicroSEQ Assays Workflow6/6125 g固体样品 +225 mL BPW（若需要增菌）OR 225 mL 生理盐水（若无需增菌）25 g液体样品 +225 mL BPW（若需要增菌）OR直接取样进行检测（若无需增菌）均质：8000 r/min10000 r/min 均质 1 min2 min。或放入盛有 BPW肉汤无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min，制备成1:10样品匀液增菌（可选择） ：36 1

5、培养8 h18 h不需要增菌样品，直接取1:10样品匀液上清液或样品原液备用抽提核酸：机器自动化提取或者手工提取Real time PCR检测：配置反应体系、设置程序、仪器运行、软件分析打印检测结果详细检测流程以沙门式菌为例7/61 MicroSEQ 检测系列 TaqMan 检测系列沙门氏菌单增李斯特菌大肠杆菌 O157大肠杆菌 O104 李斯特菌属 霍乱/副弧/创伤弧菌三重检测 沙门氏菌(肠道、肠炎）大肠杆菌O157:H5阪崎肠杆菌单增李斯特金黄色葡萄球菌大肠杆菌菌属空肠弯曲杆菌产酸克雷伯菌 伤寒沙门菌 VTX01/VTX-2白色念珠菌8/61冻干试剂优点缩短手动操作时间因为较少移液步骤，在

6、不一样时间、操作者和试验室之间提升结果可重复性和一致性降低污染风险降低试剂浪费在任何Applied Biosystems 实时荧光定量PCR 平台上运行, 标准或快速模式试剂稳定储存于28C，不会因冻融而造成试剂损伤保留期限为生产日期后18个月检测程度与液体试剂相当或更加好9/61目标：利用特异性TaqMan荧光定量PCR技术, 建立大肠杆菌O157H7快速敏感特异检测方法。方法：以大肠杆菌O157H7rfbE基因作为靶序列, 设计一对引物和探针, 优化引物和探针浓度比和Mg2 +浓度, 以大肠杆菌O157H7和10种相关细菌考评检测体系灵敏性、稳定性和特异性。结论：该方法特异性强, 稳定性高

7、, 操作简便快捷, 适应食品微生物检验发展需要, 含有较大推广及应用价值。大肠杆菌O157 H7实时荧光PCR快速检测方法建立结果：引物和探针浓度为0.6moL/L、0.8moL/L, Mg2 +浓度为4mmoL/L时, 含有良好特异性和敏感性。在10株相关菌株检测中, 除大肠杆菌O157 H7出现很好阳性外, 其余菌株均为阴性。定量检测低限为17cfu/mL。同一样品重复检测3次Ct值变异系数均小于5%。图1 大肠杆菌O157H7 TaqManPCR检测灵敏性扩增结果表1 大肠杆菌O157H7 TaqManPC检测体系引物和探针序列仪器平台：ABI 730010/61食源性病毒因其蛋白质外壳

8、保护作用，能够在食品加工、储备及人体消化过程中生存下来，并经过病人分辨，经口传输和扩散，造成食源性疾病大规模暴发流行。由食源性病毒所致人、畜疾病是一个全球性公共卫生问题。1988年上海暴发甲肝疫情，30万人死亡。所以甲型肝炎、病毒性肠炎及其它病毒性疾病对人类造成健康损害,仍是当今社会一个主要生物性危害原因。另外，伴随人口年纪逐步老龄化，经济活动和食品贸易交往日益全球化，病毒性食源性疾病发生也将不停增加。食源性病毒包含： 呕吐类：诺如病毒 ； 肝炎类：肝炎病毒 水样腹泻类：诺如病毒、轮状病毒、星状病毒、肠道腺病毒 其它病毒 病原微生物病毒检测主要性11/61 1. Isolate RNA 2.

9、Combine sample with CeeramTools Assay 3. Perform amplification on thermal cycler4. Analyze results using Real-Time PCR SofftwareIsolate RNA using Nucleic Acid Extraction Kit from samplesPrepare the reaction mixNoVGI/IPC Master Mix RT-PCR enzyme mixRNA sample QS 12K, ViiA7, QS7, 7900HT, 7500, 7500 Fa

10、st, StepOne ,StepOnePlusReal-Time PCR SofftwareCeeramTools RT-PCR一步法试剂盒Workflow12/61ceeramTools 一体化、即用型RT-PCR一步法试剂盒诺如病毒(GI 和 GII型)检测试剂盒诺如病毒(GI 和 GII型)定量标准品快速、准确、可靠食源性病毒检测方案诺如病毒检测方案速度和可重复性 90分钟出结果一步检测可大大降低试验间差异可信结果 高达100%病毒特异性/地址5个基因拷贝数样本都能在一次反应中灵敏检测到易于使用 即用型产品意味着最少手工操作13/61甲型肝炎病毒检测试剂盒快速、准确、可靠食源性病毒检测

11、方案甲型肝炎病毒检测方案甲型肝炎病毒定量标准品14/61快速、准确、可靠食源性病毒检测方案戊型肝炎病毒检测方案戊型肝炎病毒检测试剂盒戊型肝炎病毒定量标准品15/61快速，准确，可靠食源性病毒检测方案门果病毒提取对照试剂盒16/61牡蛎中G型诺如病毒快速检测方法研究目标：建立牡蛎中G型诺如病毒快速有效检测方法，为食源性疾患疫情暴发溯源提供可靠试验室依据。方法：梯度稀释含有G型诺如病毒便悬液分别加入牡蛎消化道组织匀浆中，用蛋白酶K 消化 PEG6000 沉淀方法富集后，实时荧光T PC 进行终端检测，评定灵敏度及回收率。结果：该方法灵敏度为3 91 103 copies /g，病毒平均回收率为6

12、64%。结论：该法操作简单、快速，有望深入优化后应用于不一样贝类中病毒检测。北京市丰台区疾病预防控制中心，北京市疾病预防控制中心食物中毒诊疗溯源技术北京市重点试验室仪器平台：ABI 7 500 Fast图1 G诺如病毒绝对定量标准曲线图2 牡蛎中诺如病毒扩增曲线17/61食品安全转基因（GMO）检测18/61转基因目标及监管主要性在基因分子水平上利用当代生物技术，将某一生物体上一个或者几个含有特定功效基因转移到另一生物体，以取得人们所期望生物品种或产品。不过因为转基因技术潜在不确定性,致使其安全性问题备受人们关注。 转基因食品是否含有毒素，从而对人体健康造成损害？转基因食品是否会引发新过敏性反

13、应？转基因技术会不会增加人体反抗生素耐药性？世界各国立足于本国国情考虑到潜在风险,采取了对应办法对转基因食品进行有效地监管。大致分为三派:以美国为代表宽松派;以欧盟为代表严格派;以日本为代表折中派。转基因食品问题是一个包括生命科学、经济、法律、社会等方面问题。19/61截取一段抗病基因-接入载体质粒-转入土壤杆菌-感染植物细胞-整合到细胞染色体-生成新植株病原体找出编码抗原蛋白基因抗原基因接入载体质粒带有病原基因质粒 转入土壤杆菌 土壤杆菌转染植物细胞植物细胞整合到细胞染色体中植物细胞生成新植株抗原基因转基因示意图20/61转基因产品PCR检测特异性比较植物基因组开启子外源目基因终止子植物基因

14、组特 异 性低高1) 筛选PCR2) 基因特异性PCR3) 结构特异性PCR4) 品系特异性PCR21/61 1. Isolate DNA 2. Combine sample with CeeramTools Assay 3. Perform amplification on thermal cycler4. Analyze results using Real-Time PCR SofftwareIsolate DNA using GMO Extraction Kit from samplesPrepare the reaction mix35S Master Mix / TNOS Mast

15、er Mix / P34S-FMV Master Mix / Plant Master Mix / General Master Mix DNA sample QS 12K, ViiA7, QS7, 7900HT, 7500, 7500 Fast, StepOne ,StepOnePlusReal-Time PCR SofftwareTaqMan GMO Screening Kit Workflow22/61详细检测流程以转基因玉米为例 SN/T1196-制样1、称取50g玉米样品2、150度干热预处理2h以灭菌3、120度、30min高压消毒处理碾钵或粉碎机研磨至样品颗粒约 为0.5mm左右

16、模板DNA提取1、称取1g玉米粉样2、CTAB法抽提DNA3、或者用对应市售DNA提取试剂盒提取DNA实时荧光PCR检测1、设置对照：阴性目标DNA对照、阳性目标DNA对照、扩增试剂对照（水为模板）2、配置反应体系，每个样品做2个平行管3、设置反应程序50度，2min，PCR前往污染95度，10min，预变性96度，15S；60度，1min；45个循环23/61GMO检测试剂盒4组双重qPCR: P35S/CaMV, P34S/FMV, TNOS/A. tumefaciens, 内源基因/内质控 滤膜法，大样品量（10-15克固体、10mL液体）LOQ = 20 copiesLOD = 3 D

17、NA copies, LOQ = 20 copiesTaqMan GMO Screening Kit, PN 4466334TaqMan RR Soya Quantification Kit, PN 4466335TaqMan Maize Quantification Kit, PN 4481972 LOD = 3 DNA copies, LOQ = 20 copiesGMO Extraction Kit (PN 4466336)24/61仪器平台：ABI 7500GMO大豆 荧光定量检测某待检样品大豆内源基因：lectin （+）转基因元件： CAMV35S, NOS, EPSPS（-）结果

18、：未检出CAMV35S, NOS, EPSPS 元件Lectin CAMV35S NOS EPSPS 0.1% 转基因标准物质大豆内源基因：lectin CT-24.2转基因元件： CAMV35S CT-35.8 NOS CT-33.88 EPSPS CT-34.525/61食品安全肉源性成份检测26/61检测肉源性成份主要性对研究者、消费者、食品工业和政策制订者等来说,食品真伪都是一个热点问题,尤其是肉类工业。初，数家超市和连锁餐厅出售加工牛肉产品中发觉马肉，造成一系列产品召回肉类产品掺假和真伪一直是欧洲，中国和美国头条新闻，造成了世界各地越来越多加工肉类物种判定检测。食品真伪判别，“牛肉膏

19、”、“假猪蹄”，假肉歪风正起；牛羊成份使疯牛病风险倍增 严格意义来讲，这一类肉类掺假未必真会带来食品安全问题，但这种违法行为实际上打击了消费信心，也包含一些潜在风险，比如兽药滥用、动物疫病等。市场上3大关注点: 标签上标注（配方）OK？ 食品含不含猪肉（清真/犹太）？ 素食产品含不含肉类？27/61从5-20 g 样品进行均质使用核酸提取试剂盒从5-20 g 样品中抽提DNA1、抽提核酸使用 RapidFinder 物种 ID 试剂盒用荧光定量PCR方法检测采取荧光定量PCR软件进行结果分析2、肉源性成份定性检测若结果阳性, 用RapidFinder 物种 ID 试剂盒和 RapidFinde

20、r 多重肉类定量试剂盒进行定量分别进行肉类特异和通用动物反应与试剂盒中标准品稀释产生标准曲线进行比较3、肉源性成份定量RapidFinder Species ID and Quant Multi-Meat Set Workflow28/61肉源性成份详细检测及定量流程-以马肉检测为例准备蛋白酶 K(PK) 和 RNase. 设置加热块至 56C，孵育器至 65C在50 ml 管中加入10g匀浆样品和20ml裂解液165C 孵育30 min3500 g 离心 5 min转移385 L 上清液至1.5 ml 离心管中，加 25 l 蛋白酶PK 并混匀56C 孵育1 h加入400 l 裂解液2. 混

21、匀. 70C孵育10 min加入420 l 乙醇，并混匀转移 600 l 至过滤柱. 11,000 g 离心1 min. 弃废液.加入剩下样品，重复上一步使用新搜集管, 加入500 l 洗涤液1， 11,000 g 离心1 min. 弃废液.加入600 l 洗涤液2，11,000 g 离心1 min. 弃废液，重复离心，并弃废液将过滤柱放到新1.5 ml 离心管上，加入 50 l 70C 无菌水. 室温孵育3 min. 11,000 g 离心1 min 搜集DNA 样品.核酸提取试剂盒 PN44663361、抽提核酸29/612、荧光定量PCR定性检测RapidFinder马肉 ID 试剂盒

22、A15570肉源性成份详细检测及定量流程-以马肉检测为例 1、融化预混液和阳性对照管，涡旋，置于冰上.2、在1.5 ml 离心管中，加入: 7.5 l 马肉预混液 12.5 l 通用预混液 5 l DNA 样品 （10 ng/l）* *对照反应分别用阳性对照和水代替3、用光学膜封板，或光学盖盖管，瞬时离心4、扩增:5、分析：靶标 = FAM 通道. IPC = VIC 通道 Ctcut-off = 3.32 + Ct阳性对照 假如 Ct样品 Ctcut-off , 样品不含马肉 假如Ct样品 Ctcut-off , 样品含有马肉注意：每个样品做两个重复!没有检测到马肉DNA检测到马肉DNA样品

23、中含有PCR抑制剂样品中马肉DNA含量很高30/61肉源性成份详细检测及定量流程-以马肉检测为例A、梯度稀释物种（如马肉）标准品注意：每个样品做两个重复!2、荧光定量PCR定量检测RapidFinder物种 ID试剂盒 RapidFinder 多重肉类定量试剂盒 +31/611、融化马肉和动物预混液. 涡旋混匀后置于冰上。2、在1.5 ml离心管中，为每个样品，对照或标准品分别制备2个反应： 7.5 l 马肉预混液12.5 l 通用预混液 或 5 l DNA 样品（10 ng/l）*对照反应中用稀释标准品或阴性对照替换3、用光学膜封板，或光学盖盖管，瞬时离心4、扩增：5、分析： 7.5 l 动

24、物预混液12.5 l 通用预混液 5 l DNA 样品（10 ng/l）*RapidFinder物种 ID试剂盒 RapidFinder 多重肉类定量试剂盒 肉源性成份详细检测及定量流程-以马肉检测为例动物马肉解释可定量不可定量样品中没有检测到马肉或样品中检测到马肉量低于定量下限可定量可定量总动物DNA中马肉DNA量是X%不可定量不可定量样品中检测到马肉DNA和动物DNA均低于定量下限32/61动物源性成份检测产品检测饲料检测清真/犹太食品在AB全部实时荧光定量PCR仪上都进行过优化产品名称货号 规格物种名称 GMO 提取试剂盒 A15570 48 rxn RapidFinder 牛肉ID 试

25、剂盒 A24391 48 rxn 牛 RapidFinder 猪肉 ID试剂盒A24392 48 rxn 野猪RapidFinder 鸡肉 ID试剂盒A24393 48 rxn 原鸡 RapidFinder 火鸡肉 ID试剂盒A24394 48 rxn 吐绶鸡RapidFinder 羊肉ID试剂盒A24395 48 rxn 绵羊 RapidFinder 家禽肉ID试剂盒A24397 48 rxn 许多禽类,包含原鸡（鸡），吐绶鸡（火鸡），绿头鸭（鸭），鸵鸟（鸵鸟），以及雁（鹅）RapidFinder 反刍动物ID试剂盒A2439648 rxn 家牛(牛肉), 绵羊(羊), 山羊， 马鹿(赤鹿)

26、, 狍 RapidFinder 鱼肉 ID试剂盒A24398 48 rxn 大西洋鲑鱼, 琵琶鱼, 鳕鱼, 狗鳕，大比目鱼，石斑鱼，鲚鱼，鳎目鱼，比目鱼，鲑鱼，虎鲨，欧洲鳗，赤刀鱼RapidFinder 多重肉类定量试剂盒A24399 48 rxn 33/61物种检测RapidFinder 肉类 ID试剂盒, 每个试剂盒48次反应检测线粒体DNA (单拷贝区域)试剂盒包含：阳性对照(含 0.1% 靶标 DNA) 靶标DNA 预混液通用预混液易于使用: 实时荧光定量 PCR, 无需电泳可靠: 内部阳性对照能够排除PCR过程中抑制剂影响 灵敏度很高: 鲜肉中检出下限为0.01% (w/w) 注意全

27、部 RapidFinder 物种ID试剂盒循环条件相同34/61物种定量RapidFinder 多重肉类定量试剂盒, 每个试剂盒48次反应检测线粒体DNA (16S单拷贝区域)试剂盒包含:定量标准品多重肉类 预混液通用预混液与一个或多个ID试剂盒结合使用牛肉，猪肉，马肉，家禽肉，鸡肉，火鸡肉 易于使用: 实时荧光定量 PCR, 无需电泳可靠: 内部阳性对照能够排除PCR过程中抑制剂影响 灵敏度很高: 鲜肉中定量下限为0.05% (w/w) 结果:% 物种 DNA = 物种 DNA/总动物DNA X 10035/61基于TaqMan技术进行肉类判定方案优点可靠和高特异-Real-time PCR

28、, 无需电泳灵活-在任何食品中，不论是生肉还是经过加工肉类产品，特定肉类DNA都能进行检测准确-内部阳性质控 (IPC)用以排除PCR抑制剂带来干扰快速-一天之内，从样品到结果设计和开发合作搭档- Life Technologies企业与全球客户进行合作，设计、研发优异性能PCR Assay,进行肉类判定和其它食品安全检测36/61检品：牛肉丸仪器：ABI 7500肉类判定试剂盒：RapidFinder Beef/Chicken/Pork ID Kit应用案例：牛肉丸中肉源性成份判定37/61公共卫生流感病毒检测埃博拉病毒检测严重急性呼吸道症候群（SARS）生物安全病原体检测38/61人兽共患

29、病对公共卫生安全影响及监测主要性当前,全世界已证实人畜共患病约250各种，由联合国确定在公共卫生方面含有主要意义人畜共患病有90种，其中当前在许多国家流行，危害严重人畜共患病有近40种。危害人体健康：如狂犬病、炭疽病、禽流感、鼠疫、猪丹毒、布氏杆菌病、结核病等，对人感染很高，身体健康受到严重损害。危害畜牧业安全生产：造成大批畜禽死亡；生产性能下降，淘汰率提升，使用寿命短；大量畜禽产品废弃，既影响了环境，也降低了效益；影响消费者心理，造成恐慌，从而造成养殖户收入下降，养殖业难以发展，畜牧业生产不景气。危害畜产品安全和公共卫生人畜共患病一个主要传输渠道就是食入感染。所以，食源性病原微生物是畜产品安

30、全一个主要内容。畜禽中很多人畜共患病没有得到净化，成为食源性病原微生物主要起源。39/61流感病毒通用检测流程采取H7N9病毒检测试剂盒，通常情况下可在3-5小时内检测出样本是否为H7N9病毒。荧光定量PCR技术可以对来源广泛样本多种疫病病毒核酸进行自动检测。该方法能够提供其他检测方法无法比拟快速、简便和准确优点。流感样病例抗病毒治疗甲型流感病毒抗原快速检测采集呼吸道标本核酸检测、病毒分离阳性阴性抗病毒治疗阳性阴性确诊病例排除人类感染H7N9禽流感40/61流感病毒核酸检测流程（Real Time-PCR）1、样品处理及核酸抽提2、配置PCR反应体系3、设置程序并运行RT-PCR实验4、数据分

31、析Isolate RNA using Nucleic Acid Extraction Kit from samplesPrepare the reaction mixMaster Mix RT-PCR enzyme mixRNA sample QS 12K, ViiA7, QS7, 7900HT, 7500, 7500 Fast, StepOne ,StepOnePlusReal-Time PCR Sofftware41/61核酸提取试剂盒 AM18361、抽提核酸详细检测流程-以甲型流感病毒（H7N9）为例1、试剂准备1.1 把Carrier RNA加入到Lysis/Binding Solu

32、tion，混合后加入异丙醇，配制成裂解/结合液。混合完成后，存放于室温。 a 混合以下两种试剂 每个反应 整瓶 Lysis/Binding Solution Concentrate 65l 8ml Carrier RNA 1l 125l b 混合片刻，然后加入异丙醇 65l 8ml 1.2 加入12ml异丙醇到Wash Solution 1，存放于室温，配制成洗涤液1。 1.3 加入32ml已醇（酒精）到Wash Solution 2，存放于室温，配制成洗涤液2。 1.4 准备Bead Mix （磁珠混合液）：每个反应需要20 l磁珠混合液，尽管该混合液能够在4放置2星期，我们依然推荐您在试验

33、当日配制新鲜磁珠混合液。配制方法以下： 成份 每个反应 96个反应（+ 10%） RNA Binding Beads 10 l 1.1ml Lysis/Binding Enhancer 10 l 1.1ml 注意：我们推荐多准备10%试剂来防止加样误差。 磁珠混合液配置好后，放 置于冰上，直到使用。 MagMax24自动化核酸提取仪+42/61核酸提取试剂盒 AM18361、抽提核酸详细检测流程-以甲型流感病毒（H7N9）为例2、运行机器，抽提病毒RNA2.1 接通电源，打开开关。 2.2 按照下表要求将样品和试剂加入专用 8 联管中2.3 放置专用样品板到托板上。 2.4 在磁头套滑槽中插入

34、磁头套。 2.5 在前控制面板上选择适当程序。 2.6 按START键。 2.7 运行结束后移除样品板和磁头套。 MagMax24自动化核酸提取仪+43/612、荧光定量PCR定性检测自行合成引物探针，采取通用预混液(AgPath one-step RT-PCR kit )进行检测配置PCR反应体系1、室温融化预混液、引物、探针，涡旋，置于冰上备用2、在0.2 ml 离心管中按下表配置反应体系，加入: Components volume（L） 2 RT-PCR Master Mix 12.5 primer-forward（40M） 0.5 primer-reverse（40M） 0.5 Pro

35、be （20 M） 0.5 25xRT-pcr enzymes mix 1 Template RNA 5.0 RNase Free H2O 5 Total 25 注：不一样引物对和探针加在不一样反应管中，采取阳性和阴性对照反应3、用光学膜封板，或光学盖盖管，瞬时离心4、扩增: 45 10min ；95 10min ；95 15s 、60 45s ；40Cycles5、分析： 假如 Ct样品 Ctcut-off , 阴性 假如Ct样品 Ctcut-off , 阳性详细检测流程-以甲型流感病毒（H7N9）为例44/61WHO推荐使用AgPath one-step RT-PCR kit（AM1005

36、） 45/61人传染病检测类别货号品名包装大小核酸抽提AM1836MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit96 反应AMB1836-55x MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit5 x 96反应44623595x MagMAX Pathogen RNA/DNA Kit5x 96反应AM1939MagMAX Viral RNA Isolation Kit50 反应通用预混液AM1005AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit100 反应H1N1pdm4456927Pandemic H1N1/09 Assay Set v2.0

37、1000 反应4456926Pandemic H1N1/09 Assay Controls v2.0200 反应甲型流感4415200VetMAXTM-Gold SIV Detection Kit100 反应（25uL）冻干粉A/H5/H74398276VLA TaqMan Influenza A Detection Kit96 反应4398277VLA TaqMan Influenza H7 Subtyping Kit96 反应4398312VLA TaqMan Influenza H5 Subtyping Kit96 反应神经氨酸酶活性4457091NA-FluorTM Influenza

38、 Neuraminidase Assay Kit960 反应4457535NA-XTDTM Influenza Neuraminidase Assay Kit960反应客户定制产品(引物探针混合液)4466628TaqMan H1N1pdm/FluB/H1/H3 4-plex Assay 流感4重100 反应（25uL）TaqMan FluA/H5/H9 triplex Assay 禽流感3重100 反应（25uL）4401512TaqMan Norovirus Assay* 诺如病毒100 反应（30uL）TaqMan Candida albicans Assay* 白色念球菌(DNA) 1

39、00 反应（30uL）* 带IPC内质控 猪流感通用型试剂盒对甲型流感覆盖率最高46/61生物安全检测类别货号品名包装大小核酸抽提AM1840MagMAX-96 Total NA Isolation Kit100 反应检测试剂4382490TaqMan Francisella tularensis Detection Kit 土拉热杆菌100反应4382486TaqMan Bacillus anthracis Detection Kit 炭疽杆菌100 反应4382423TaqMan Brucella spp. Detection Kit 布鲁氏菌100反应4382488TaqMan Yers

40、inia pestis Detection Kit 鼠疫100反应47/61禽流感亚型H7N9荧光定量PCR检测仪器平台：750048/61目标：建立一个快速准确检测埃博拉病毒（）亚型方法。方法：依据中公布基因序列，设计引物和探针，经过优化反应条件，建立一种检测扎伊尔亚型和苏丹亚型一步法荧光定量方法。结论：本文将荧光定量技术用于埃博拉病毒定量检测中，而且建立了扎伊尔亚型和苏丹亚型荧光定量检测方法，含有一定创新性。该方法建立对加紧我国诊疗技术研究含有主要推进作用。一步法荧光定量-检测埃博拉病毒扎伊尔亚型和苏丹亚型方法建立一步法荧光定量敏感性试验线性扩增曲线一步法荧光定量特异性试验线性扩增曲线49

41、/61动物传染病控制动物健康50/61动物疫病危害性及监测主要性动物疫病引发大批动物死亡，造成巨大经济损失，引发动物生产性能下降动物疫病防疫消耗大量财富动物疫病发生日趋严重，成为长久制约我国畜牧业发展、妨碍畜产品国际贸易重要因素，并可能成为引发公共食品安全事件以及危害人民身体健康重要隐患。人兽共患疾病威胁人类健康51/61优先防治的国内动物疫病一类动物疫病（5种）口蹄疫（ O型、亚洲型、 A型）高致病性禽流感 高致病性猪蓝耳病猪瘟新城疫二类动物疫病（11种）布鲁氏菌病（共患）奶牛结核病狂犬病猪伪狂犬病、经典猪蓝耳病马传贫和沙门氏菌等11种动物疾病我国方针政策国家中长久动物疫病防治规划（)农业部

42、公告 第1125号 附件（12月11日）一、二、三类动物疫病病种名目52/61荧光定量PCR技术对动物疫病检测策略样本处理及核酸抽提采样DNA病原RNA病原PCR扩增，经过CT值判定结果阴阳性RT-PCR扩增，经过CT值判定结果阴阳性磁珠法自动化核酸提取仪，同时高效抽提DNA与RNA 1、采取市售检测试剂盒，进行检测2、采取荧光定量PCR预混液，合成引物探针，进行检测53/61 1. Isolate RNA 2. Combine sample with CeeramTools Assay 3. Perform amplification on thermal cycler4. Analyze

43、results using Real-Time PCR SofftwareIsolate RNA using Nucleic Acid Extraction Kit from samplesPrepare the reaction mixMaster Mix RT-PCR enzyme mixRNA sample QS 12K, ViiA7, QS7, 7900HT, 7500, 7500 Fast, StepOne ,StepOnePlusReal-Time PCR SofftwareTaqman蓝耳病病毒(PRRSV)一步法试剂盒Workflow54/61猪病检测试剂盒-Taqman蓝耳病病毒(PRRSV NA/EU)快速、 高效地检测蓝耳病，同时汇报北美和欧洲型分型结果，在1.5小时内得到定量结果。一步法定量RT-PCR节约时间，操作大大简化，将交叉污染降低到最低程度。特异性高，非常灵敏，能稳定检测出低于40个RNA分子。利用人工合成Xeno RNA作为内参考监控每一个反应，防止假阴性汇报55/61