西南林大现代生化仪器分析讲义

1、PAGE PAGE 95第一章 绪 论仪器分析法是用精密仪器测量物质的物理性质或物理化学性质以确定其化学组成、含量及化学结构的一类分析方法。HYPERLINK 2.项目预算表1.xls介绍与专业有关的仪器 生命科学：DNA测序；活体检测；环境科学：环境监测；污染物分析；材料科学：新材料，结构与性能；药物：天然药物的有效成分与结构，构效关系研究；外层空间探索：微型、高效、自动、智能化仪器研制仪器分析发展和作用20世纪40年代后：仪器分析的大发展时期，确立了仪器分析的地位；原因：（1）物理学+电子技术+精密仪器制造技术的发展（2）社会发展的迫切需要（发展动力，连续化大生产的迫切需要）；分析化学包括

2、仪器分析和化学分析, 仪器分析：通过最佳的物理方法获取尽可能多的化学信息 .仪器分析的发展阶段阶段一： 16世纪，天平的出现。分析化学具有了科学的内涵； 20世纪初，依据溶液中四大反应平衡理论，形成分析化学的理论基础。分析化学由一门操作技术变成一门科学； 这一阶段为分析化学的第一次变革； 20世纪40年代前，化学分析占主导地位，仪器分析种类少和精度低；阶段二:20世纪40年代后，仪器分析的大发展时期。 仪器分析使分析速度加快，促进化学工业发展；化学分析与仪器分析并重，仪器分析自动化程度低； 一系列重大科学发现，为仪器分析的建立和发展奠定基础。 （1）Bloch F 和Purcell E M；建

3、立了核磁共振测定方法；诺贝尔化学奖1952年；（2）Martin A J P 和Synge R L M；建立了气相色谱分析法；诺贝尔化学奖1952年；（3）Heyrovsky J，建立极谱分析法，诺贝尔化学奖1959年仪器分析的发展引发了分析化学的第二次变革。 阶段三：八十年代初，以计算机应用为标志的分析化学第三次变革。 （1）计算机控制的分析数据采集与处理：实现分析过程的连续、快速、实时、智能； 促进了化学计量学的建立。（2）化学计量学：利用数学、统计学的方法设计选择最佳分析条件，获得最大程度的化学信息。 化学信息学：化学信息处理、查询、挖掘、优化等。（3）以计算机为基础的新仪器的出现： 傅

4、里叶变换红外光谱；色-质联用仪第一章: 光谱分析基础电磁辐射高速通过空间传播的光子流。 电磁辐射属于微观粒子，故电磁辐射具有波粒二象性，且符合普朗克量子理论。 波长愈短，光子的能量愈大。物质内部的运动，在外部可以用辐射或吸收能量的形式表现出来，当物质内的原子或分子的能级变化（E）与任一波长光子的能量相等时，则物质可吸收或发射辐射辐射能。 电磁波谱电磁辐射按波长顺序排列称为电磁波谱. 广义讲，各种电磁辐射都属于光谱，通常按波长进行分类。波谱区名称 波长范围 跃迁能级类型射线 510-3-0.14nm 核能级射线 10-3-10nm 内层电子能级远紫外区 10-200nm 内层电子能级近紫外区 2

5、00-400nm 原子、价电子可见区 400-760nm 原子、价电子近红外区 50-1000m 分子振动能级中红外区 2.5-50 m 分子振动能级远红外区 50-1000 m 分子振动能级微波区 0.1-100cm 电子自旋、核自旋射频区 1-1000m 电子自旋、核自旋原子光谱由于原子核外电子在不同能级间跃迁而产生的光谱称为原子光谱。它们有表现形式为线光谱。原子光谱包括原子吸收光谱、原子发射光谱和原子荧光光谱分子光谱在辐射能的作用下，分子内能级间的跃迁产生的光谱称为分子光谱。其表现形式为带光谱。分子光谱包括红外光谱、可见和紫外吸收光谱、分子荧光光谱和拉曼散射光谱。发射光谱物质的原子、离子

6、或分子得到能量，使其由低能态或基态激发到高能态，当其跃迁回到较低能态或基态时产生的光谱称为发射光谱。荧光光谱某些物质的分子或原子在辐射能作用下跃迁至激发态，在返回基态的过程中，先以无辐射跃迁的形式释放出部分能量，回到第一激发态，然后再以辐射跃迁回到基态，由此产生的光谱称为荧光光谱。荧光光谱实质上是一种发射光谱。吸收光谱当电磁辐射通过气态、液态或固态（透明）物质时，物质的原子、离子或分子将吸收与其内能变化相对应的能量，由基态或低能态激发到较高的能态。这种基于物质对辐射能的选择性吸收而得到的原子或分子光谱称为吸收光谱。光谱分析方法及其主要用途方法名称 辐射能作用物质 主要用途紫外可见分光光度法 分

7、子、外层价电子 单元素或分子定量 原子吸收分光光度法 气态原子外层电子 单元素定量红外光谱法 分子振动或转动 结构分析有机物定性定量原子发射光谱法 气态原子外层电子 元素连续或同时定性定量原子荧光法 气态原子外层电子 微量单元素定量X射线荧光光谱法 原子内层电子 常量元素定性定量分子荧光光谱法 分子 微量单元素或分子定量光电子能谱法 原子或分子 表面及表层定性定量第二章 紫外可见分光光度法紫外可见分光光度法是在比色法的基础上发展起来的；它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性定量分析及结构分析。所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。分子能

8、级电子能级的能量差e较大,120eV。电子跃迁产生的吸收光谱在紫外可见光区，称为紫外可见光谱或分子的电子光谱；振动能级的能量差v约为：0.05eV，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，为红外光谱或分子振动光谱；转动能级间的能量差r：0.0050.050eV，跃迁产生吸收光谱位于远红外区。称为远红外光谱或分子转动光谱；分子从外界吸收能量后，就能引起分子能级的跃迁，即从基态能级跃迁到激发态能级。分子可吸收二个能级之差的能量。 例：5ev能量其相应的波长为：分子能级：evr 电子能级跃迁所需的能量较大，其能量一般在1-20eV。故产生的吸收光谱主要处于紫外、可见光区（200-780 nm），这种分子光谱称

9、为电子光谱或紫外可见光谱。一、紫外可见吸收光谱:由分子价电子能级跃迁而产生的吸收。波长范围：100-800 nm.(1) 远紫外光区: 100-200nm (2) 近紫外光区: 200-400nm (3)可见光区:400-800nm电子跃迁的同时，伴随着振动转动能级的跃迁;形成带状光谱。紫外可见吸收光谱 ：分子吸收光谱、有机化合物的紫外吸收光谱、无机化合物的紫外及可见吸收光谱、影响紫外可见吸收光谱的因素有机化合物的紫外吸收光谱紫外吸收光谱是由于分子中价电子的跃迁而产生的，因此，这种吸收光谱决定于分子中价电子分布和结合情况，按分子轨道理论，在有机化合物分子中有几种不同性质的价电子：键电子形成单键

10、的电子。键电子形成双键的电子。n电子未成键的孤对电子。 例：在甲醛分子中有三种电子存在C-H单键：电子。C=O双键：电子。o原子：n电子。当有机化合物分子中的价电子吸收一定能量后，价电子将跃迁到较高的能级（激发态）。这些跃迁可分成如下4类：1、NV跃迁：由基态轨道跃迁到反键轨道；包括饱和碳氢化合物中的 ，不饱和烯烃中的 跃迁。2、NQ跃迁：分子中未成键的n电子激发到反键轨道的跃迁，包括n 及n 跃迁。3、NR跃迁：是键电子逐步激发到各个高能级，最后电离成分子离子的跃迁。4、电荷迁移跃迁：在光能激发下，某化合物的一部分迁移至另一部分而产生的吸收光谱。分子内的轨道能级图为：各种跃迁所需能量不同，其

11、大小顺序为： * n * * n * 电子跃迁所处的波长范围及强度为：饱和烃：分子中只有单键，只能产生 *跃迁，因而一般吸收带在远紫外区。即10-200 nm。这类化合物在200-1000 nm范围内无吸收带，故在紫外吸收光谱分析中常用作溶剂。 当饱和烃中氢原子被O、N、X、S等原子取代时，由于这类原子中有n电子，能发生n r*跃迁，使电子跃迁所需能量降低，吸收峰向长波方向移动。例：CH4 125-135nm CH3I 150-210nm CH2I2 292nm 能使吸收峰波长向长波方向移动的杂原子基团叫助色团（如：-NH2，-NR2，-OH，-OR，-SR，-Cl，-Br，-I）不饱和脂肪烃

12、主要包含烯烃和共轭烯烃。这些物质的分子内存在着一个或多个像CC、 C=O、N=N这些含有电子的基团，吸收能量后产生 *跃迁。可使这类化合物的最大吸收峰波长移至紫外及可见光区范围内，使物质具有颜色。 使物质具有颜色的基团称为生色团（发色团）。 共轭烯烃含共轭双键的化合物，由于 -共轭效应，生成大键，在键各能级间的距离较近，电子容易激发，所以吸收峰的波长就增加，生色作用加强。 如：乙烯max=171nm,丁二烯max=217nm,这种由于共轭双键中 *跃迁所产生的吸收带称为K吸收带。K吸收带的特点强度大，摩尔吸光系数通常在10000-200000L/mol.cm之间；吸收峰位置一般处在217-28

13、0 nm范围内。共轭双键愈多，深色移动愈显著，甚至产生颜色，据此判断共轭双键的存在情况，这是紫外吸收光谱的重要应用。芳香烯烃B吸收带的产生是由于 *跃迁和苯环的振动的重叠引起B吸收带为芳香族化合物的特征吸收带，在苯环上有取代基时，复杂的B吸收带变得简单化，即峰数减少。但吸收强度增加，同时发生深色移动。除此之外，苯在185和204处有两个吸收带，分别称为E1和E2吸收带，也是芳香族化合物的特征吸收带。无机化合物的紫外及可见吸收光谱1. 电荷迁移跃迁当电子从给体外层轨道向受体跃迁时会产生较强的吸收，这样产生的光谱称为电荷迁移光谱。2. 配位场跃迁 f电子跃迁-镧系和锕系元素在配体存在下会分裂成几组

14、能量不同的轨道，当吸收能量后能产生f-f跃迁，产生光谱。d电子跃迁-过渡金属元素的五个能级在配体存在下会分裂成两组能量不同的轨道，当吸收能量后能产生d d电子跃迁，产生光谱。电荷迁移跃迁d电子跃迁影响紫外可见吸光光谱的因素 1. PH值许多化合物具有酸性或碱性可离解基团，PH值不同，分子离解形式不一样，其吸收光谱也不一样。2. 温度室温：影响不大;低温：吸收峰红移，峰尖，强度增加;高温：谱带变宽，精细结构消失 3.溶剂同一种物质，溶剂不同，紫外光谱的峰形和最大吸收位置不同。极性溶剂对溶质吸收峰的波长，峰强及形状可能产生影响紫外可见吸收光谱的应用一、紫外可见分光光度计：紫外可见分光光度计可测定的

15、范围：200-1000 nm 光源：有钨丝灯及氢（氘）灯两种，钨丝灯-可见光区（360-1000 nm），氢（氘）灯-紫外区（200-400 nm） 单色器：使用石英棱镜（或光栅）。吸收池（比色皿）：使用石英制成。检测器：氧化铯光电管-用于625-1000 nm，锑铯光电管-用于200-625 nm。 紫外吸收光谱的应用定性分析：以紫外吸收光谱鉴定有机化合物时，通常是在相同的条件下，比较未知物与已知标准物的紫外光谱图，若两者的谱图相同，则可以认为待测试样与已知化合物具有相同的生色团。 利用紫外吸收光谱作定性鉴定时，除对照标准谱外，可参考其吸光系数；不同物质即使紫外吸收光谱一致，但吸光系数是有差

16、异的，如果待测物和标准物的吸收波长相同，吸光系数也相同，则可认为两者是同一物质。纯度检查: 如果一化合物在紫外区没有吸收峰，而其中的杂质有较强吸收，就可以方便地检出该化合物中的痕量杂质。定量测定: 单组分测定标准曲线法：配制一系列已知浓度的标准溶液，测定其A值，作AC图，测定待测液Ax，查图得Cx。标准对比法：已知浓度标准液Cs,测定As；待测液Cx,测定Ax。则 多组分定量测定第三章 红外光谱法红外光谱是由于分子振动能级的跃迁（同时伴随着转动能级跃迁）而产生的，因此又称为分子振动转动光谱。 红外光谱分子结构基础研究应用红外光谱可以测定分子的键长、键角，以此推断出分子的立体构型等化学组成的分析

17、可根据光谱中吸收峰的位置和形状来推断未知物结构，依据特征吸收峰的强度来测定混合物中各组分的含量等红外光谱与有机化合物结构纵坐标为吸收强度，横坐标为波长 （ m ）和波数1/ （）单位：cm-1可以用峰数，峰位，峰形，峰强来描述。 第一节 红外光谱的基本原理红外光谱产生的条件: 辐射应具有能满足物质跃迁时所需能量辐射与物质之间有偶合作用（相互作用）对称分子：没有偶极矩，辐射不能引起共振，无红外活性。 如：N2、O2、Cl2 非对称分子：有偶极矩，红外活性。 分子振动方程式: 简谐振动分子中的原子以平衡点为中心，以非常小的振幅作周期 性的振动。 分子振动方程式K化学键的力常数，与键能和键长有关 为

18、双原子的折合质量 m =m1m2/（m1+m2） 某些键的伸缩力常数（毫达因/埃）键类型 CC C =C C C 力常数 15 17 9.5 9.9 4.5 5.6峰位 4.5m 6.0 m 7.0 m 化学键键强越强（即键的力常数k越大）原子折合质量越小，化学键的振动频率越大，吸收峰将出现在高波数区。 例题: 由表中查知C=C键的k=9.5 9.9 ,令其为9.6, 计算波数值。 正己烯中C=C键伸缩振动频率实测值为1652 cm-1 影响基本振动频率的因素1、对于具有相似质量的原子基团来说，振动频率与力常数成正比；2、对于相同化学键的基团，振动频率与相对原子质量平方根成反比。分子振动的形式

19、: 非直线分子3n-6种 直线分子3n-5种伸缩振动：指原子沿键轴方向伸缩，使键长发生变化的振动。变角振动（弯曲）：基团键角发生周期性变化的振动。包括对称弯曲振动，不对称弯曲振动、面内、面外（扭曲）、面内摇摆、面外摇摆振动等。二氧化碳分子的四种基本振动形式对称伸缩振动反称伸缩振动面内弯曲面外弯曲“红外光谱的吸收强度”: 红外光谱的吸收强度取决于分子振动时偶极矩的变化；振动时偶极矩变化越大，吸收强度也越大. 极性越强，吸收强度越大C=O，C-ClC=C，C-C /氢键越强，吸收也越强/分子对称性越强，吸收强度越弱R-CH=CH2 R-CH=CH-R红外光谱的特征性、基团频率: 红外光谱的特征性同

20、一类型的化学键的振动频率 非常相近。 基团频率与一定结构单元相联系的振动频率称为基团频率。位移由于化学结构单元所处的化学环境不同，而使基团频率发生的移动特征基团频率区氢键区：O-H，N-H，C-H，S-H；4000-2500cm-1叁键或累积双键区：-CC-，-C N，-C=C=C-，-C=C=O，-N=C=O；2500-1900cm-1双键区：C=C，C=O，C=N，-NO2，苯环；1900- 1200cm-1 单键区：C-H，N-H，C-O，C-X，C-C； 1650cm-1基团频率区分区基团的特征吸收大多集中在4000-1350cm-1区域内，故这一段频率范围称为基团频率区（特征频率区）

21、在1350-650 cm-1的低频区，称为指纹区；分子结构的微小变化，会引起指纹区光谱的明显改变。影响基团频率位移的因素外部因素：试样状态、测定条件的不同及溶剂极性。内部因素: 诱导效应、氢键、杂化影响、振动偶合、费米共振、空间效应及环的张力杂化影响C原子的杂化轨道中S成分越多，C-H伸缩振动频率越大。H3C-CH3 （C-H）：3000-2850 cm-1 H2C=CH2 （C-H）：3095-3000 cm-1 HCCH （C-H）：3300 cm-1 振动偶合振动频率相近的两个振动基团，它们之间可能产生相互作用而使谱峰裂分为两个峰，一个高于正常频率，一个低于正常频率。这种两个振动基团之间

22、的相互作用，称为振动偶合。第二节红外光谱定性分析红外光谱分光光度计和傅里叶变换红外光谱计光源: 能斯特灯：发光强度高，适用大于1000 cm-1 的高波数区域。硅碳棒：发光面积大，适用小于200 cm-1的低波区域。 吸收池：不能用玻璃、石英等材料，用NaCl、KCl、CsI、KRS-5等材料制成的窗片。单色器: 色散元件, 准直镜, 狭逢检测器：采用真空热电偶制成。记录系统：需自动启示录仪。图谱解析一般程序1、先从各个区域的特征频率入手，推测未知物可能含有的基团，判断不可能含有的基团。2、发现某基团后，再根据指纹区进一步核证该基团及其与其他基团的结合方式，找出可能含有基团的相关峰，用一组相关

23、峰来确认一个基团的存在。3、由此再根据元素分析数据等定出它的结构，最后用标准谱图进一步验证之。第四章 色谱分析基础一、 色谱法的特点、分类和作用1.概述 混合物最有效的分离、分析方法。 俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置：色谱原型装置，如图。 色谱法是一种分离技术， 试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。 其中的一相固定不动，称为固定相； 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。 色谱法当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的

24、大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础 2.色谱法分类 (1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）。 按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱； 按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱液相色谱(2)液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。 离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。(3)其他色谱方法薄层色谱和纸色谱

25、： 比较简单的色谱方法凝胶色谱法：测聚合物分子量分布。超临界色谱: CO2流动相。 高效毛细管电泳: 九十年代快速发展、特别适合生物试样分析分离的高效分析仪器。3.色谱法的特点（1）分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2） 灵敏度高 可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3） 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4） 应用范围广 气相色谱：沸点低于400的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。 不足之处： 被分离组分的定性较为困难。二、色谱分离过程:色谱分离过程是在色谱柱

26、内完成的。 填充柱色谱: 气固(液固)色谱和气液(液液)色谱，两者的分离机理不同。气固(液固)色谱的固定相: 多孔性的固体吸附剂颗粒。固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。气液(液液)色谱的固定相: 由 担体和固定液所组成。固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。气固色谱的分离机理:吸附与脱附的不断重复过程；气液色谱的分离机理: 气液(液液)两相间的反复多次分配过程气相色谱分离过程 当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附; 随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附; 挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附;随着载气的流动，溶解、

27、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。 2分配系数（ partion factor） K组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示，即：分配系数是色谱分离的依据。 分配系数 K 的讨论一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。 3.分配比 （partion radio）k

28、在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：分配比也称： 容量因子(capacity factor)；容量比(capacity factor)； 1. 分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。 2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。 3. 分配比可以由实验测得。 4. 容量因子与分配系数的关系式中为相比。 填充柱相比：635；毛细管柱的相比：501500。 容量因子越大，保留时间越长。 VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙

29、体积； VS为固定相体积，对不同类型色谱柱， VS的含义不同； 气-液色谱柱： VS为固定液体积；气-固色谱柱： VS为吸附剂表面容量；5分配比与保留时间的关系 滞留因子（retardation factor）： us：组分在分离柱内的线速度；u：流动相在分离柱内的线速度；滞留因子RS也可以用质量分数表示： 若组分和流动相通过长度为L的分离柱，需要的时间分别为tR和tM，则：由以上各式，可得： tR = tM(1+k) 三、色谱流出曲线与术语1.基线 无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。 2.保留值（1）时间表示的保留值 保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间； 死

30、时间（tM）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间； 调整保留时间（tR ）：tR= tRtM （2）用体积表示的保留值保留体积（VR）： VR = tRF0 F0为柱出口处的载气流量，单位：m L / min。 死体积（VM）： VM = tM F0 调整保留体积(VR)： V R = VR VM 3. 相对保留值r21组分2与组分1调整保留值之比：r21 = tR2 / tR1= VR2 / VR1 相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。4. 区域宽度用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法： （1）标准偏差()：即0.607倍

31、峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度 Y1/2 =2.354 （3）峰底宽(Wb)：Wb=4 第二节 色谱理论基础色谱理论 色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？ 组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定液的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论； 塔板理论-柱分离效能指标1.塔板理论（plate theory）半经验理论: 将色谱分离过程比拟作蒸馏过程

32、，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复 （类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）； 塔板理论的假设：(1) 在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到； (2) 将载气看作成脉动（间歇）过程；(3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；(4) 每次分配的分配系数相同。色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为： n = L / H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为：保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配! 2.有效塔板数和有效塔板高度 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。 组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效

33、塔板高度： 3.塔板理论的特点和不足 (1)当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。 (2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。 (3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。 (4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。 二、 速率理论-影响柱效的因素1. 速率方程（也称范.弟姆特方程式） H = A + B/u

34、+ Cu H：理论塔板高度，u：载气的线速度(cm/s) 减小A、B、C三项可提高柱效； 存在着最佳流速； A、B、C三项各与哪些因素有关？A涡流扩散项 A = 2dp dp：固定相的平均颗粒直径 ：固定相的填充不均匀因子固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。B/u 分子扩散项B = 2 Dg ：弯曲因子，填充柱色谱， 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)4. 选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试

35、剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。 液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。2.流速流速大于0.5 cm/s时, Hu曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，

36、柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。3.固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。 3.原理SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱SFC；分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离；通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值；压力效应：SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍

37、），对分离有影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）；超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，影响小，超过临界压力20%，柱压降对分离的影响小；压力效应：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。CO2流动相，当压力改变：7.09.0106 Pa，则：C16H34的保留时间 25min 5min。2.主要部件（1）SFC的高压泵 无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量； （2）SFC的色谱柱和固定相 可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱； SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱SFC；（3）流动相 SFC的流动相：超临界流体；CO2、N2O、NH3 CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改