用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型

1、1材料与方法1. 2主要试剂环磷酰胺、RPMI 1640培养液（含L-谷氨酰胺，）、Hanks液（HyClone）、MTT试剂、PBS缓冲溶液（pH值7. 27. 4, HyClone）、丝裂霉素”SA缓 冲液，绵羊红细胞，补体（豚鼠血清）、都氏试剂、LDH基质液、 P815细胞（购于协和医科大学基础医学细胞中心）、YAC-1细 胞、FITC-Anti-CD3、 PE-Anti-CD4、 PerCP-Anti-CD8 荧光抗体）。2动物与分组Balb /C小鼠90只，雌性，68周龄，体重1822g。颗粒饲 料，室温（22 土 2） C，湿度60%80%。动物在实验室条件下检疫1周后，实验分为3

2、项处理进行，（1）处理一:测定动物体重、脾脏重量及系数；（2）处理二： 测定NK细胞活性，细胞毒性丁细胞活性；（3）处理三:测定血 清半数溶血值。每项处理随机分为空白对照组、CTX-1组和 CTX-2 组。1. 3实验方法和测定指标1. 3. 1剂量选择试验前经急性经口毒性试验确定CTX 的LD50为240mg / kg，以1 /4 LD50做为本试验中CTX-1组的 CTX剂量，即60 mg / kg环磷酰胺，用蒸馏水配制，每日经口给 予。CTX-2组每日经口给予蒸馏水，试验结束前一天经腹腔 注射给予动物200 mg / kg环磷酰胺2, 3（用蒸馏水配制）。另 设空白对照组，蒸馏水代替受试

3、物，每日经口给予。动物灌胃 容积为0. 3ml /10g，每周称量体重调整灌胃量，连续灌胃4周 后测定各项免疫指标。1. 3. 2血液中T、B淋巴细胞分类计数4动物处死前眼 眶内眦静脉取血，EDTA-K2抗凝，每只设定3支流式试管进行 测定，每管加入50p l抗凝血。分别在3管中加入CD3 /CD19 ，CD3 /CD4 /CD8.不同荧光素标记的单克隆小鼠抗体。每管加 入2ml FACS红细胞裂解液，室温下避光保存20min。1200r / min离心5min，弃去上清液。每管再加入2ml PBS，1200r /min 离心5min，弃去上清液。加入0. 5ml PBS混匀后上流式细胞仪进行

4、 检测。1. 3. 3细胞毒性丁淋巴细胞活性试验5, 61. 3. 3. 1脾细胞悬液的制备（效应细胞）无菌取脾，用4层 纱布将脾磨碎，制成单细胞悬液。用Hank s液洗2次，每次离 心10min（1000r /min）。弃上清将细胞浆弹起，加入0. 5ml灭 菌水20s，裂解红细胞后再加入5ml Hank s液，混匀后1000r / min，10min离心，用1ml含10%小牛血清的RPMI1640完全培 养液重悬，调整细胞浓度为2 X 107个/ml;加0. 5ml此细胞悬 液于24孔培养板，留一孔不加脾细胞作为对照孔。1. 3. 3. 2制备刺激细胞1000r /min，10min离心处

5、于对数生 长期的P815细胞，用5ml DMEM培养液悬浮P815细胞于 15ml离心管中，计数细胞。加入丝裂霉素C，相当于50p g / （2 5） X 107个细胞。用锡纸包裹离心管以避光，在37C水浴 30min。用Hank s液洗P815细胞3次，之后Hank s液悬浮P815细胞，室温孵育1520min后，离心1次。将P815悬浮 于培养液中，计数细胞及活性，调整终浓度为1. 2 X 106个/ ml,加0. 5ml此悬液于含有脾细胞悬液的24孑匕（包括对照孔） 板中。37C、5% CO2孵育5天。5天期间，每隔一天换一次液。 1. 3. 3. 3制备效应细胞收集24孔培养板中的培养

6、物，用 Hank s液洗1次，200r /min离心10min，收集细胞，重悬于 RPMI1640培养液中，计数细胞及活性，调整细胞浓度2 X 107 / ml。用完全培养液配制3个系列稀释的细胞悬液，每个稀释 度100p l，做3个复孔。1. 3. 3. 4制备靶细胞离心处于对数生长期的P815细胞， 重悬于0. 5ml Hank s液里，离心后重悬于RPMI1640完全培 养液，调整细胞浓度为2 X 105个/ml。1. 3. 3. 5 CTL检测按效应细胞和靶细胞比为100 : 1、50 ： 1、 25 : 1和12. 5 : 1（各加100p l）在圆孔96孔培养板的培养孔中 加入细胞

7、，每孔液体总体积为200p l，设3个复孔。同时设靶 细胞自然释放对照组（0. 1ml靶细胞+ 0. 1m培养液）和最大 释放对照组（0. 1ml靶细胞+ 0. 1ml 1% NP-40液），效应细胞 对照孔（0. 1ml效应细胞+ 0. 1ml培养液），用96孔板水平转 头500r /min 离心5min， 37C、5% CO2 培养4 6h。1000r /min离心5min，每孔吸取100p l上清，加于另一ELISA反应板的 孔中，每孔中加入新鲜配制的底物液50p ，室温避光反应 30min后，每孔加入50p l终止液，终止酶促反应。在酶联检 测仪492nm波长下读取各孔A值，CTL活性

8、用杀伤率表示， 按如下公式计算:CTL杀伤率（% ）=（实验孔A值一靶细胞 对照孔A值一效应细胞对照孔A值）/ （靶细胞最大释放孔A 值一靶细胞对照孔A值）X 100%。1. 3. 4 NK细胞活性测定1. 3. 4. 1靶细胞传代实验前24h将靶细胞进行传代培养， 应用前以Hank s液洗2次，用RPMI1640完全培养液调整细 胞浓度为4 X 105个/ml。1. 3. 4. 2效应细胞和靶细胞之比经纯化的小鼠脾细胞，用 RPMI1640完全培养液调整细胞浓度。效应细胞的数量为 5 X 106个/ml，效应细胞和靶细胞之比为50 : 1。1. 3. 4. 3 NK细胞活性测定反应孔加靶细胞

9、和效应细胞各 100M l于96 aU形培养板，靶细胞自然释放孔，加靶细胞和 培养液各100p l，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%的NP40 或2. 5% Triton各100p l，每样做3个平行样。37C、5% CO2 条件下培养4h。培养结束后，96孔培养板1500r /min离心 5min，每孔吸取上清100p l置于平底96孔板中，同时加入 LDH基质液100p ，室温避光反应3min，每孔加入1mol /L的 HCl 30p l，在酶标仪490nm处测定A值。用下列公式计算： NK细胞活性（% ）=（反应孔A值一靶细胞自然释放孔A 值）/ （最大释放孔A值一靶细胞自然释放孔A值）X

10、 100%。1. 3. 5半数溶血值的测定（HC50 ）1. 3. 5. 1制备补体采集豚鼠血，分离出血清(至少5只豚 鼠的混合血清)，将1ml压积SRBC加入到5ml豚鼠血清中， 放4C冰箱30min，经常振荡，离心取上清，分装，一70C保存。 用时以SA液按1 ： 8稀释。第3期齐丽娟，等.用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制动物模型3151. 3. 5. 2免疫动物及血清分离制备压积绵羊红细胞(SRBC)，并用生理盐水配成2% ( V /V)的细胞悬液，每只鼠腹 腔注射0. 2ml进行免疫。45天后，由动物眼眶内眦静脉取 血，2000r /min离心10min收集血清。1. 3. 5. 3溶血反应

11、取血清用SA缓冲液稀释(一般为 200500倍)。将稀释后的血清1ml置试管内，依次加入 10% SRBC 0. 5ml，补体1ml(用SA液按1 : 8稀释)。另设不加 血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置37C恒温水浴中保温 1530min后，冰浴终止反应。2000r /min离心10min。取上 清液1ml，加都氏试剂3ml，同时取10% SRBC 0. 25ml加都氏 试剂至4ml，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管 作空白，分别测定各管光密度值。按下列公式计算HC50o HC50 =样品光密度值SRBC半数溶血时的光密度值X稀释倍数4统计分析采用SPSS 13. 0统

12、计软件进行方差分析或非参数检验。2结果1 CTX不同给药方法对Balb /C小鼠体重及免疫器官重 量的影响由表1可见，CTX-1组和CTX-2组小鼠体重较对照组显 著降低(P 0. 001)。CTX-1组小鼠脾脏绝对和相对重量较 对照组增高(P 0. 001)，CTX-2组小鼠脾脏绝对和相对重量 较对照组降低(P 0. 001，P 0. 05)。表1 CTX不同给药方法对Balb /C小鼠体重及免疫器官重量的影响Table 1 The weight and absolute and relative spleen weight in each group( n = 8, 旃x 土 s) 组别体

13、重(g) 脾脏绝对重量(g)相对重量( )对照组22. 36 土 1. 06 0. 071 土 0. 007 0. 319 土 0. 031 CTX-1 组 16. 31 土 2. 05 (3) 0. 081 土 0. 018 (1) 0. 505 土 0. 142 (2)CTX-2 组 19. 18 土 0. 48 (3) 0. 047 土 0. 009 (2) 0. 243 土 0. 042 (1)注:与对照组比较(1) P 0. 05，(2) P 0. 0012 CTX不同给药方法对Balb /C小鼠淋巴细胞分类计数 的影响由表2可见，CTX-1组小鼠外周血LYM和LYM(% )、B淋巴

14、细胞(CD -3 CD +19) (%)、T 淋巴细胞(CD+3 CD -19) (%)、 Th细胞(CD +3 CD +4 CD -8) (% )和Ts 细胞(CD +3 CD -4 CD + 8) (% )及Th /Ts比值均较对照组显著降低(P 0. 05) ;CTX-2组 小鼠外周血LYM和LYM(% )、B淋巴细胞(% )较对照组降低(P 0. 001) ; CTX-2组小鼠外周血T淋巴细胞( )、Th细胞 (% )、Ts细胞(% )及Th /Ts比值较对照组增高(P 0. 001, P 0. 001, P 0. 05, P 0. 05, P 0. 001)。表2 CTX不同给药方法

15、对Balb /C小鼠外周血淋巴细胞分类计数的影 响Table 2 Phenotypic analysis results of peripherial blood T lymphocytes in each group( n = 8,旃x 土 s) 组别CD -3 CD +19(% ) CD +3 CD-19(% ) CD +3 CD +4 CD-8(% ) CD +3 CD -4 CD +8(% ) Th /Ts(% ) LYM LYM(% ) TOC o 1-5 h z 对照组 15. 76 土 7. 29 49. 88 土 8. 58 29. 90 土 13. 33 11. 08 土 5

16、. 18 2. 29 土 0. 70 16. 60 土 6. 20 67. 13 土 7. 79 CTX-1 组0.20土0.17(3)4. 03 土 2.00(3)1.12 土 1.37(3) 1. 34土 0. 84(3)0. 72 土 0. 41(3)2. 89土 1. 95(3)56. 11 土 15. 96 (2)CTX-2 组3.31土1.74(3)88. 37 土 2. 95 (3)65. 53 土23.69 (1) 15.96土1.38(1)4. 14 土 1.60(3)1.97 土 2.28(3) 11. 72 土 3. 51 (3)注:与对照组比较(1) P 0. 05,

17、(2) P 0. 01, (3) P 0. 001 2. 3 CTX不同给药方法对Balb /C小鼠HC50、CTL细胞活 性和NK细胞活性的影响 由表3可见，CTX-1组和CTX-2组NK细胞活性(% )较 对照组显著降低(P 0. 05)。CTX-1组和CTX-2组CTL细胞活性(% )均较对照组显 著降低(P 0. 05)。CTX-1组和CTX-2组小鼠HC50 均较对照组显著降低(P 0. 05)。表3 CTX不同给药方法对Balb /C小鼠HC50、CTL细胞和NK细胞活性的影响Table 3 The HC50, CTL cell and NK cell activity chang

18、es in each group( n = 8,旃x 土 s) 组别HC50CTL细胞活性( )NK细胞活性( )对照组49.24 土 29.93 7.17 土 4.26 12.16土 8.30CTX-1 组6.89 土 2.23 (1)2. 24 土1. 35(1)5. 96土 2. 80(1)CTX-2 组4.05 土 2.19 (1)2. 42 土2. 67(1)4. 67土 3. 57（1）注：（1）与对照组比较P 0. 053讨论环磷酰胺作为一种免疫抑制剂，已有大量研究表明其能抑制动物的体液和细胞免疫应答，造成动物的免疫抑制7-9 。 本实验研究结果表明:正常小鼠连续30天灌胃CTX 60mg / kg （CTX-1组）和腹腔注射200mg / kg CTX（ CTX-2组）1天均引 起小鼠较为严重的免疫抑制。外周血淋巴细胞数目和百分比 下降(P 0. 01)、体重下降(P 0. 001)、CTL细胞活性和NK 细胞活性下降(P 0. 05)、HC50 下降(P 0. 05)。有研究发现