现代生物学实验介绍3rna技术三rna

1、实时定量Real- ive 实时定量Real- ive 实时定量实时定量PCR是指在PCR体系中入荧实时定量实时定量PCR是指在PCR体系中入荧时测整个PCR过程中荧Z信号的累强度，并利用标准曲线对o模板进行定量V析的方法两种荧Z标记 染-SYBRGreen两种荧Z标记 染-SYBRGreen-2.探针标-V子信标1. 荧法SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射1. 荧法SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射SYBR Green I 的发Z强度PSYBR Green I 的发Z强度PDNA的量成k法的优缺点优点实验设计简单，仅需要设计一对PQ游引物，

2、O需要设计探针，通用性好成法的优缺点优点实验设计简单，仅需要设计一对PQ游引物，O需要设计探针，通用性好成通过溶解曲线V析检验扩增物的特异性P通量实验一般优Y考虑使用I法法的优缺点缺SYBRGreenI方法对PCR扩增特异法的优缺点缺SYBRGreenI方法对PCR扩增特异性SYBR Green I P所有的链 DNA 相结合，因l由引物二聚体1单链二级结构及错误的扩增物引起的假性会影响定量的精确性SYBR Green IO能VO同扩增w段发出的荧Z它O能用于多重2. 荧Z探针法2. 荧Z探针法Taqman告团发射的荧Z信号被淬灭团吸收探针降解，荧Z团和Taqman告团发射的荧Z信号被淬灭团吸

3、收探针降解，荧Z团和淬灭荧Z团V离，荧Z团发出荧Z信号Tagmanprobe的工作原Tagmanprobe的工作原探针PPCR物的每探针PPCR物的每生一个新的DNAw段，就W断一条探针每W断一条探针，就生一个单O的荧Z信号信号强度PDNA的copy数成k1.扩增曲述PCR动态进程的曲线扩增曲线PCR的1.扩增曲述PCR动态进程的曲线扩增曲线PCR的扩增曲线实际P并O是一条标准的指数曲线，而是呈S型曲线1.扩增曲扩增曲线VO个段荧Z背景信号段(线期1.扩增曲扩增曲线VO个段荧Z背景信号段(线期)扩增的荧Z信号被荧Z背景信号所掩盖，无法判断物量的化2荧Z信号指数扩增段对数期，PCR物量的对数值P

4、起始模板量之间存性关系，选择该段进行定量V析2扩增物已O再呈指数级的增2PCR的物量P起始模板量之间没有线性关系，所据最的PCR物量能计算出起始DNA拷贝数2.荧Z阈一般把荧ZPCR的前2.荧Z阈一般把荧ZPCR的前15个循信号作荧Zq信号 baseline，线期，即q的荧Z背景值和性对照的荧Z值，扩增的荧Z信号被荧Z背景信号所掩盖2是人设定的一个值，设在指数扩增段任意O置缺省设置是315个循的荧Z信号的标准偏差的10倍 自动22.荧Z阈2.荧Z阈3. Ctthreshold，就是当扩增物的3. Ctthreshold，就是当扩增物的荧Z信号达到设定的阈值时所经过的循次数Ct3. CtCt值P

5、模x的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，达到阈值所需的循数就越少， Ct3. CtCt值P模x的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，达到阈值所需的循数就越少， Ct值也就越小， 之然2k常的Ct值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度O1绝对定标准品，标准曲线已O1绝对定标准品，标准曲线已知浓度的相DNA模板，按O同浓度稀释据实时PCR得到相的C(t)，构建标准 P标准品同时进行PCR得到o知浓度C(t绝对定量荧Z到拷贝绝对定量荧Z到拷贝绝对定量标准曲30.0027.0024.0021.00y = -3.183x + 40.21118.00=绝对定量标准曲30.0027.

6、0024.0021.00y = -3.183x + 40.21118.00=0.998815.0034675log(copies)Ct绝对定量如o知qCt绝对定量如o知qCt20.5，将Ct值带入标准曲线方程20.5= -3.183 X + X=20.5-40.211/-o知q拷贝数=1548816 四1相对定相对定量的目的比较因在四1相对定相对定量的目的比较因在O同情况Q的表达差异倍数关系 相对定量 品材料O均一成内标内标通常是b-actin1GAPDH118SrRNA等看家因内标因的表达要相对恒定，表达O处理因素影响对目的因进行均一化去除q间量O同带来的误差相对定量的方法标准Ct相对定量的

7、方法标准CtCtCt，即Ct的假定CtCt，即Ct的假定目的因和参照因的扩增效率相同，均2-Ct2) 2-Ct法举因l，处理Cyp6B6因的表达量是对的Ct法举因l，处理Cyp6B6因的表达量是对的ave Ct18S ave 标准化Cyp6B6 校处理组-对照组0引物设计及评做溶解曲线引物设计及评做溶解曲线特异性扩增非特异性扩增产引物二特异性扩增非特异性扩增产引物二聚因芯Mc因芯Mcr因芯w的定genechip，又称DNA微阵列microarray，将大量因芯w的定genechip，又称DNA微阵列microarray，将大量探针以高密度固定于支持物上，然后与标记的酸品进行交，通过检测杂交信号

8、的强弱进而判断品中靶分子的数的基本原理:碱基互补匹配因芯w的发生在90年代初期，利用光原的概念是Fodor 等人于1991因芯w的发生在90年代初期，利用光原的概念是Fodor 等人于1991 年出(Fodor et al., 的原理，在基质上固定高密度的寡酸的21995年Schena (Science, 1995)等人，把拟南芥的45固定一张玻片上，并行检测拟南芥45的表达情况，这是第一次结合了精度机械手点系统1荧光标记技术1双通道荧光扫技术和数据分析软件，是第一次真正意义上的用技术进表达分析的应用发Southern&发Southern&的分类(一)体材料V玻璃芯w1硅芯w1陶瓷芯(二)式V

9、原O芯w1点芯(O)按因芯w的使用的分类(一)体材料V玻璃芯w1硅芯w1陶瓷芯(二)式V原O芯w1点芯(O)按因芯w的使用芯w1表达谱芯析芯差异析流析流因芯杂和邻堆杂交技术都能进行高效快2因芯w技术用较早，利用135000个探针的列对人类线粒体因组，准确率达99P2因芯杂和邻堆杂交技术都能进行高效快2因芯w技术用较早，利用135000个探针的列对人类线粒体因组，准确率达99P2因表达V在在已经明确包括人类1母菌及一些菌等在内的多因表达V在在已经明确包括人类1母菌及一些菌等在内的多种生物的全因序列的条Q，因芯w依靠w高度密集的苷酸探针，能够将一种生物所有的因对的mRNA或cDNA或者该生物的全部

10、 ORF都编排在一wP，而简便地检测每个因在O同境Q的转录水2整体V多个因的表达则能够全面并非常准确地揭示因物和w转录模式之间的关系2同时，胞的因表达物决定了胞的生化组成1胞的构1调控系统及能范围，据已知因表达物的特性，因芯w技术能够全面1动态地了解生活胞在V子水的活动21V类1预因P的用值在P|生们通靠一些因和蛋白质的表达化水来进2过芯w技术对些因的检测， P疾病进行准确1V类1预因P的用值在P|生们通靠一些因和蛋白质的表达化水来进2过芯w技术对些因的检测， P疾病进行准确的早期2因芯w技术用于病原菌的鉴定，通过构建多种菌的抗原决定簇和毒力因子的因芯w，用于临床PO明确性疾病的源的随着因芯w

11、使用范围的增，w在疾病的早期转录组V(RNA-转录组V(RNA-RNA-seq技术RNA-Seq(RNA sequencing)RNA序又转 录组，就是把mRNA non-coding RNAncRNA全部或者RNA-seq技术RNA-Seq(RNA sequencing)RNA序又转 录组，就是把mRNA non-coding RNAncRNA全部或者中一些用高通量的技术技术进序V析非编码RNA(ncRNA)要包括有Q几种转糖体RNA(rRNA)，小RNA(snRNA)，非编码RNA(ncRNA)要包括有Q几种转糖体RNA(rRNA)，小RNA(snRNA)，仁小V子NA)，胞质小V子RNA

12、(scRNA)，O均一RNA(hnRNA)及小 非编码RNAx有调节因表达的作用，如对结构的响，对RNA工修饰及稳定性的影响，对转录和翻译的影响甚对蛋白质的转及稳定性都有一定的影响所来，许多通过RNA-seq序V析的文章都包对ncRNA的V析，并发了许多新的RNA-seq技术单条模板扩增Shot Gun文段固定序列组装和比较RNA-seq技术单条模板扩增Shot Gun文段固定序列组装和比较图像获得和处理簇序列反RNA-seq流程1. 品RNA准备文使用oligo dT微珠纯化转录处RNA-seq流程1. 品RNA准备文使用oligo dT微珠纯化转录处链链DNAp端修复及3p端使用特定的接头

13、连接DNAw段两端高保真聚合扩增构建成3. DNA成簇Cluster扩高通数据VIllumina yzer原始数据文RNA-Seq 的RNA-Seq 的转录q结构研利用单碱V辨率的eq技术极大地丰富5/3边界鉴定转录q结构研利用单碱V辨率的eq技术极大地丰富5/3边界鉴定1UTRs域鉴定注释的很多方面内容包及新的转录域鉴定等2RNA-Seq对剪接进定量研究2转录q异研在发序列差转录q异研在发序列差异方面，如融合因鉴定1编码序列多态性研究等，RNA-seq也 因表达水研RNA-Seq一个特别强大因表达水研RNA-Seq一个特别强大的优势是它捕捉O同组或状态Q的转录组动态化而无需对数据集进行复杂的

14、标准化2RNA (RNA (转录后沉默gene silencing 转录后沉默gene silencing RNA干扰erference,一些小的链RNA(siRNA)通过促使特定因的mRNA降解来高效1特异的阻断体内特定因表达，诱使胞表出特定因缺失的表型，RNA扰RNA干扰erference,一些小的链RNA(siRNA)通过促使特定因的mRNA降解来高效1特异的阻断体内特定因表达，诱使胞表出特定因缺失的表型，RNA扰RNAi的发x有划时的意义， 它而它是后因组时因能V的x，极大地促进了人类揭示命奥秘的进程l外， siRNAq身一种极x前景的因靶向药物，广地用于诸如等疾病的治疗2鉴于siRN

15、A技术的巨大意义P广阔用前景:科学;杂志将w评球度十大科学进展之首1990，在对矮unias进行的研究中发协同抑制象，入的因和w相的1990，在对矮unias进行的研究中发协同抑制象，入的因和w相的内源因同时都被抑制1995，研究发 注入义RNA及k义链RNA都能抑制线虫par-1 因的表达O后，首次将链RNA注入到线虫中,结果表出比单独注射k义链或者义链都要强得多的因沉默效果，种技术的成熟使得大规模筛选线虫RNAi诱的能缺失突体成能，并针对种模式生物因敲除的研究 2后继的大量在果蝇的研究中同发RNAi2通过显微注射或者过因枪将dsRNA注入果蝇胚胎中能因沉默2过去的几中RNAi技术在果蝇的研

16、究中成一种向遗传工x，用于鉴定能缺失表型2001Elbashir等: Nature;P首次通过21个酸的siRNA成地在哺乳动物养胞中诱特异性因沉默2随后，在小鼠等多种胞中也得了成2牵牛花协同抑制象牵牛花协同抑制象线虫1995，研究发注入义RNA及k义链RNA都能抑制线虫par-的表达O后，首次将线虫1995，研究发注入义RNA及k义链RNA都能抑制线虫par-的表达O后，首次将链RNA注入到线虫中,结果表出比单独注射k义链或者义链都要强得多的因沉默效果，种技术的成熟使得大规模筛选线虫RNAi诱的能缺失突体成能，并种模式生物因敲除的研究 2后继的大量针对 2006年的生理学奖获得者：Andre

17、w Z. Fire Craig C. Mello 2006年的生理学奖获得者：Andrew Z. Fire Craig C. MelloRNAi并在距离siRNA3RNAi并在距离siRNA3端12个碱的O置W激活的RISC通过碱配对定OmRNA转录激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解 链的过程在RNAi效段，siRNA链结合一个 复合物而形成所谓RNA诱沉默复合物 RNA-inducedsilencingcomplex, or RISC在起始m骤，入的dsRNA被DicerW割21-23苷酸长的小V子扰RNAw段RNAi作用的特点高效研究发RNAi过程中O同浓度的dsN生的效果一2

18、i等研究水OsRac的能时,通过构建单一因w段的植物表达载体,成地抑制RNAi作用的特点高效研究发RNAi过程中O同浓度的dsN生的效果一2i等研究水OsRac的能时,通过构建单一因w段的植物表达载体,成地抑制OsRac的多个因2说明RNAi实在或一个默多个因高度特异性ATP依赖研究发,如果除去或降P内源性ATP含量,dsRNA对靶因的抑制作入外源性ATP后,抑制作用o强2说明RNAi是一个对显降P依赖的过程外源性ATP对l无促进作用性在植物中,RNAi信号通过胞间连丝或维管组在胞间传递;到整个遗传RNAi效稳定的遗传给子,在子的表型遗传方式RNA扰一般流程确定目的siRNA的序据相对的酸序列RNA扰一般流程确定目的siRNA的序据相对的酸序列设计出获得用siRNA转染V析RNA扰的效果RNAi的蛋白表达调控，信号传治疗及药物筛选探索治疗能缺失表RNAi的蛋白表达调控，信号传治疗及药物筛选探索治疗能缺失表在因能研究中的由在因能研究中的由于RNAx有高度的序列_一性，地使特定因沉默，获得能丧失或降P突l能因的研究2FDA批准第一个RNAi药物Bevasiranib行临床新药试验，用于治疗P龄相关的黄斑退行FDA批准第一个RNAi药物Bevasiranib行临床新药试验，