实验七sds-page测蛋白分子量

1、SDS测蛋白分子量实验目的掌握SDS检测蛋白分子量原理和方法掌握垂直板电泳的操作方法实验步骤1、洗净玻璃板，蒸馏水冲洗3遍，吹干并安装电泳槽。2、制作12%分离胶。按下表中所列顺序加试剂，轻轻摇匀，加入两块玻璃板间，高度约玻璃板高度的一半。3、用1mL蒸馏水封住分离胶液面，室温聚合约20min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残余的水。4、倒出水并用滤纸吸干，配好5%浓缩胶，轻轻摇匀，加入浓缩胶，迅速插入样梳，静置约25分钟。 水封的目的是为了使分离胶上沿平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。样梳需一次平稳插入。梳口处不得有气泡，梳底需水平

2、。12%分离胶试剂名称12%分离胶ddH2O2.5 mL30% Acr-Bis (29:1)3.0 mL1.5M Tris-HCl（pH8.8）2.0 mL10% SDS75 uLTEMED（加速剂）10 uL10% APS（催化剂，最后加）75 uL总体积7.5 mL分离胶的高度为整个凝胶高度的一半试剂名称5%ddH2O3.4 mL30% Acr-Bis （29:1）0.86mL1M Tris-HCl（pH6.8）0.62mL10%SDS50 uLTEMED20 uL10%AP（最后加）50 uL总体积5 mL5%浓缩胶 6、将胶板放入电泳槽，加入1Tris-Gly电泳缓冲液，拔掉梳子，液面

3、应该完全没过电极。7、制样：待测蛋白40 uL+蓝色的样品缓冲液15 uL，在沸水中加热3分钟，以除掉亚稳态聚合7、点样点样孔分别点30ul、15ul和10ul样品，每板胶点20ul Marker（老师准备）。8、80V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到120V，继续电泳。溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。电泳结束。10、撬开玻璃板，将凝胶做好标记， 放在塑料盒内，加入染色液，染色30min左右。(染色液需回收，可反复使用)11、染色后的凝胶用蒸馏水煮沸脱色。（高火微波炉中煮5分钟）实验步骤蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消除了各种蛋白质分子之间原有的电荷差异。蛋白质的迁移

4、速度只取决于分子大小。在15-200KD之间，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系：logMW=K-bm实验原理不连续系统: 缓冲液离子成分、pH、 凝胶浓度及电位梯度的不连续性。 电荷效应、分子筛效应、浓缩效应。连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同。 电荷、分子筛效应。（三个不连续性）1、凝胶孔径的不连续性（2种孔径的凝胶）2、缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓冲体系，3种pH）：浓缩胶，pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl- 低，比Gly高。3、电位梯度不连续性：快离子（ Cl- ）后面形成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间的地

5、方，形成一个稳定而不断向阳极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。浓缩效应实验结果分析绘制标准曲线：log MW = K - bm 蛋白质区带中心至分离胶上沿距离 相对迁移率= 溴酚蓝至分离胶上沿距离 以每个蛋白标准的分子量对数作纵坐标，相对迁移率作横坐标，作标准曲线，然后在计算出待测蛋白的迁移率即可在标准曲线上查出其分子量。实验试剂 低分子量标准蛋白（Mark） 兔磷酸化酶B MW=97400 牛血清白蛋白 MW=66200 兔肌动蛋白 MW=43000 牛碳酸酐酶 MW=31000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20100 鸡蛋清溶菌酶 MW=1440030%丙烯酰胺（Acr）10%SDS1.0mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液1.0