乳酸菌对沙棘汁中酚酸及挥发性化合物的影响研究

1、乳酸菌对沙棘汁中酚酸及挥发性化合物的影响研究沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是胡颓子科、沙棘属落叶性灌木，广泛种植于我国西北地区。沙棘浆果富含大量天然营养物质1，沙棘果中富含酚类化合物、维生素、脂肪酸及植物甾醇等天然营养成分2。沙棘果还拥有一定的医疗潜力，具有抗氧化、抗菌、抗病毒等特性3；并且对于一些慢性疾病有着积极作用，例如高脂血症，2型糖尿病和心血管疾病4。然而沙棘果在采摘运输过程中容易受到机械损伤，将其加工成果汁、浓缩汁等产品不仅可以方便运输，还可以在一定程度上保留沙棘果中的营养成分。目前市场上的沙棘果汁产品的加工方式以添加蔗糖、甜味剂等简单的糖酸比调节为主。产品附加值

2、不高，且对消费者吸引力不强5。乳酸发酵被认为是一种保持并提高果蔬营养价值及感官特性的加工方法6。未经加工的沙棘果汁pH为22.9，这是由于沙棘汁中含有大量以苹果酸为主的有机酸7。而乳酸菌通过苹果酸-乳酸发酵可以将口感苦涩、具有刺激性酸味的苹果酸转化成口感柔和的乳酸8。此外，乳酸发酵还能提高果蔬汁的营养价值，FENG等9研究发现，乳酸菌发酵可以显著提高枸杞汁的抗氧化能力，并且类黄酮、酚类等化合物也有所增加。ZHANG等10研究发现，通过植物乳杆菌发酵的蓝莓汁酚类物质总量增加了43.42%，花青素含量提高了15.38%，且抗氧化能力也有所提高。PENG等11发现乳酸菌发酵对于苹果浊汁的香气成分也有

3、一定的改善。因此本研究选用嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌复配对沙棘果汁进行发酵，通过液相色谱质谱联用(liquid chromatography-electrospray ionisation-mass spectrometry, LC-ESI-MS)、HPLC、顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)等方法对发酵前后的酚酸、有机酸和挥发性化合物进行检测，同时对发酵前后的抗氧化性进行测定并与酚酸进行相关性分析，以期为沙棘乳酸菌产

4、品的研制提供参考。1 材料与方法1.1 主要试剂、仪器和设备植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌，上海仙农生物科技有限公司；3，5-二硝基水杨酸、冰乙酸、无水醋酸钠、2,4,6-三吡啶基三嗪(2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine, TPTZ)、DPPH、ABTS(均为分析纯)，天津市盛奥化学试剂有限公司；MRS固体培养基，海博生物技术有限公司；有机酸及酚酸标品(均为色谱级)，上海源叶生物科技有限公司；磷酸、甲醇、甲酸、乙腈、2-辛醇(均为色谱级)，上海麦克林生化科技有限公司。LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司；8890-7000D气象色谱三重四级杆质谱联用仪，安捷伦

5、科技有限公司；T9S紫外可见光分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；WSC-S色差仪，上海精密科学仪器有限公司；Vanquish超高效液相系统、Q exactive高分辨质谱系统，赛默飞世尔科技公司。1.2 发酵沙棘汁的制备沙棘购自新疆石河子，储存于(40.5) 的冷库中。挑选成熟完整的沙棘用去离子水清洗以除去灰尘和表面杂质。将沙棘果与蒸馏水按料液比11(gmL)的比例打浆，然后使用40目筛网过滤杂质。为了给乳酸菌提供生长所用碳源和适宜的酸碱度，使用白砂糖和无水Na2CO3(食品级)将可溶性固形物含量和pH分别调整为10.0和6.0，之后在75 的水浴中巴氏杀菌20 min。将沙棘汁冷却至

6、25 ，将混合乳酸菌粉m(嗜酸乳杆菌)m(植物乳杆菌)=11与无菌水以150(gmL)的比例混合，此时活菌数为1010CFU/mL，接着从中吸取0.07% (体积分数)至沙棘汁中，在37 培养48 h。作为对照，将未接种菌粉的沙棘汁置于相同的条件下48 h。实验组和对照组都为3次重复。1.3 理化指标的测定可溶性糖参照NY/T 27422022水果及制品可溶性糖的测定 3,5-二硝基水杨酸比色法测定；总酸参照GB 124562022食品安全国家标准 食品中总酸的测定pH电位滴定法测定；有机酸检测方法参照GB 5009.1572022食品安全国家标准 食品有机酸的规定对酒石酸、苹果酸、柠檬酸、乳

7、酸进行测定。岛津高效液相色谱系统，检测器SPD-20A，色谱柱选用CAPECELL PAK MG S5 C18柱，4.6 mm250 mm,5 m。使用色差仪对沙棘汁的色差进行测定，使用白板和黑板将色差仪进行预热校准，随后称取5 mL的样品进行测定分析，试验重复3次，最终结果取平均值12。1.4 抗氧化能力的测定总抗氧化能力用铁离子还原能力(ferric reducing ability of plasma,FRAP)法13测定；参照文献14的方法测定DPPH自由基清除活性；ABTS阳离子自由基清除活性参照文献15的方法稍加修改后测定。所有实验重复3次。1.5 酚酸的测定16采用LC-ESI-

8、MS分析方法对样品中酚酸进行定性定量检测，具体分析条件和分析方法如下：色谱条件：色谱系统采用超高效液相系统(Vanquish，Thermo，USA)，根据化合物的性质，采用Waters HSS T3(100 mm2.1 mm，1.8 m)液相色谱柱，进样量2 L，柱温40 。流动相A(0.1%甲酸-乙腈)，流动相B(0.1%甲酸-水)。梯度洗脱(02 min，A相10%，B相90%；28 min，A相60%，B相40%；812 min，A相10%，B相90%)。质谱条件：质谱系统采用美国Thermo公司的Q exactive高分辨质谱检测系统，配有电喷雾(ESI)离子源和Xcalibur工作站

9、。采用电喷雾离子源(ESI)，分析物在负离子同时扫描下以单离子检测(SIM)模式进行分析，该模式可以大大提高灵敏度。优化的质谱分析条件如下：鞘气40；辅助气10；离子喷雾电压+3 000 V；温度 350 ；离子传输管温度320 。1.6 HS-SPME-GC-MS挥发性化合物分析17向20 mL顶空瓶中加入1 g NaCl，然后加入5 mL样本和10 L 2-辛醇(1 000 g/L)。为吸附挥发性化合物，将萃取头插入40 顶空瓶中40 min。然后，使用带有HP-innowax (30 m0.25 mm0.25 m)毛细管柱的GC-MS (Agilent 8890-7000D)分析挥发性化

10、合物。起始温度40 ，保持2 min，然后以3 /min升至85 ，再以1 /min升至105 ，然后以3 /min升至180 ，最后以10 /min升至230 ，保持5 min。与NIST2022和Wiley 8.0数据库进行比较，通过质谱鉴定了样本中的挥发性化合物，以2-辛醇为内标测定各化合物的量，不考虑挥发性化合物的回收率和响应因素，各种挥发性化合物定量分析如公式(1)所示：挥发性化合物提取量/(gL-1)=样品质量(1)1.7 数据处理使用Origin 2022b及R软件进行作图，使用SPSS 25进行方差分析，P0.05表明差异显著。2 结果与讨论2.1 发酵前后理化指标的变化从表1

11、可看出，乳酸菌在沙棘果汁中生长良好，由可溶性糖、总酸、活菌数指标的变化可知复配乳酸菌可以很好地利用果汁中的碳源，对可溶性糖的利用率达到了42.4%，而可滴定酸含量增加了92%。据报道，乳酸菌对碳源的利用主要有两条途径：通过糖酵解(EMP)途径产生乳酸，即乳酸菌在无氧条件下将碳源分解为丙酮酸，进而将丙酮酸还原为乳酸18；另一方面乳酸菌还可以通过苹果酸-乳酸(malolactic fermentation,MLF)发酵途径将苹果酸脱羧形成乳酸，图1为有机酸测定的总离子流色谱图，对数据进行处理后得到有机酸的含量如表1所示。沙棘汁中的苹果酸含量为6.45 g/L，发酵结束时的苹果酸含量为2.34 g/

12、L，所以乳酸菌在沙棘汁中有良好的苹果酸-乳酸转化能力，通过苹果酸-乳酸转化可以将口感酸涩的苹果酸转化为柔和的乳酸，丰富了饮料的口感19。酒石酸则是水果中一种常见的有机酸，具有强烈的酸味，在乳酸发酵过程中通过酒石酸脱水酶的作用可以将酒石酸转化为乳酸和CO2，也可以在一定程度上降低果汁中酸涩的口感。柠檬酸含量在发酵前后则无显著差异(P0.05)。从理化指标可以看出，乳酸菌可以很好地改善沙棘汁的口感，并改变沙棘汁中的有机酸组成，同时活菌数也高于轻工标准QB/T 53562022果蔬发酵汁中规定的乳酸菌总数需1105CFU/mL的要求。为了进一步研究复配乳酸菌发酵对沙棘汁的影响，同时也对发酵前后的色差

13、值进行了测定，结果显示发酵前后L*、a*及b*值有显著差异，L*值的变化可能是因为乳酸菌的增殖，导致饮料的浊度增加从而引起L*值的下降，a*、b*在发酵后有明显改变，这可能是因为乳酸菌的代谢作用将大分子的酚类物质分解成小分子物质，从而改变了饮料的颜色20。图1 有机酸的总离子流色谱图Fig.1 Total ion flow chromatogram of organic acids表1 沙棘汁与发酵沙棘汁的理化指标Table 1 Physicochemical indexes of sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juice注：同

14、列不同小写字母表示差异(P0.05);ND-未检出(下同)2.2 抗氧化能力的测定水果是抗氧化剂的良好天然食物来源之一，抗氧化活性可以作为评价水果产品质量的标准之一21。对乳酸菌发酵前后沙棘汁的抗氧化能力、自由基清除能力进行了检测，总抗氧化能力结果如表2所示，发酵沙棘汁(6.15 mmol/L)显著(P0.05)高于沙棘汁(5.56 mmol/L)，发酵可显著增强沙棘汁抗氧化能力。DPPH自由基清除活性试验表明，相比于沙棘汁，发酵沙棘汁(82.2%)的DPPH自由基的清除能力提高了23.98%。ABTS阳离子自由基清除实验结果显示乳酸菌发酵沙棘汁为87.65%和沙棘汁为75.03%。相比未发酵

15、沙棘汁，发酵后的沙棘汁ABTS阳离子自由基清除能力提高了16.8%。有研究表明，乳酸菌饮料抗氧化能力的提高可归因于酚类物质的变化22。为此，在后续的研究中对酚酸进行了检测。表2 沙棘汁与发酵沙棘汁的抗氧化能力Table 2 Antioxidant capacity of sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juice2.3 发酵前后的酚酸检测结果酚酸测定的总离子流色谱图如图2所示，对数据进行处理得到酚酸的含量，从图3可以看出，沙棘汁中主要的酚酸为：阿魏酸(36.17%)、香草酸(15.34%)、咖啡酸(12.95%)、没食子酸(12.

16、79%)，而乳酸菌发酵沙棘汁中主要的酚酸分别为：阿魏酸(32.83%)、没食子酸(30.9%)、咖啡酸(11.25%)。图2 酚酸的总粒子流色谱图Fig.2 Total ion flow chromatogram of phenolic acids发酵后没食子酸和阿魏酸的含量都有显著增加(P0.05)，其原因可能是在发酵过程中pH下降形成的酸性环境减缓了酚酸的氧化。乳酸菌水解酶也可以将复杂的多酚如植物细胞壁的多酚化合物通过水解形成小分子化合物的方式释放出来，从而增加多酚物质的含量23。图3 沙棘汁与发酵沙棘汁中酚酸含量的比较Fig.3 Comparison of phenolic acid c

17、ontent between sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juice 注：不同小写字母表示差异显著(P0.05)对酚酸与抗氧化性和色度进行了皮尔逊相关性分析，如图4所示，其中没食子酸、咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸及总酚酸与DPPH自由基、ABTS阳离子自由基的清除能力呈显著正相关(P0.05)，而与FRAP抗氧化能力呈显著正相关的酚酸为没食子酸、阿魏酸、肉桂酸及总酚酸。没食子酸和阿魏酸是一种常见的抗氧化剂，还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等病理作用，对心血管疾病也有一定的治疗作用24。乳酸菌发酵对于咖啡酸的含量并没有显著影响。香草酸、丁香

18、酸、对羟基苯甲酸，水杨酸在发酵之后略有减少。这可能是由于乳酸菌代谢使得不稳定的酚酸转化成了其他物质。而发酵后没食子酸及阿魏酸显著增加(其中没食子酸较发酵前增加了183%)，这可能是发酵后DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力及FRAP抗氧化能力增加的原因之一。而对色度与酚酸的相关性分析结果显示，所有酚酸均与L*、a*、b*的变化呈显著(P0.05)相关，这说明发酵之后酚酸成分的变化是造成颜色改变的重要原因之一。图4 酚酸与抗氧化能力及色度的相关性分析Fig.4 Correlation analysis of phenolic acid with antioxidant activity

19、and chromaticity2.4 发酵前后挥发性化合物测定结果本研究共鉴定出了41种挥发性化合物(其中沙棘汁32种，发酵沙棘汁36种)，包括29种酯类化合物、5种醛类化合物、3种醇类化合物、3种酮类化合物及1种酸类化合物。从图5可知，3组平行试验之间差异不大，这说明实验的重复性较好，同时发酵前后挥发性化合物成分差异较大且发酵后挥发性化合物浓度显著增加。为了研究发酵前后香气成分的差异，通过对化合物的浓度与嗅闻阈值的比值对香气活度值(odor activity value,OAV)进行计算，OAV1的挥发性化合物被认为对风味具有贡献，发酵前的沙棘汁中共2种OAV1的化合物，分别为：异戊酸乙酯

20、(类似苹果、香蕉的香气和酸甜气味，OAV=23.38)、正己酸乙酯(水果香气，OAV=4.30)，发酵后的沙棘汁中共5种OAV值1的化合物，它们分别为：丁酸乙酯(菠萝香味，OAV=7.13)、异戊酸乙酯(OAV=29.08)、正己酸乙酯(OAV=6.19)、异戊酸异戊酯(水果香气，OAV=1.23)、月桂酸乙酯(花生香气，OAV=1.20)。乳酸菌发酵一定程度上改善了沙棘汁的风味；为了进一步分析发酵前后挥发性化合物的变化，以挥发性化合物浓度为指标，使用正交偏最小二乘法判别分析(discriminant analysis of orthogonal partial least squares, OPLS-DA)对数据进行分析处理25。图5 沙棘汁和发酵沙棘汁的挥发性化合物含量热图Fig.5 Heat map of volatile compounds content in sea buckthorn juice and fermented sea buckthorn juic