黄连上清丸微生物限度检查方法学验证

1、黄连上清丸微生物限度检查方法学验证【摘要】目的：对黄连上清丸微生物限度检查方法进展方法学验证。方法：采用平皿记数法，分组分别使用5种实验菌验证。试验组取供试液加菌液注入培养基中培养。菌液组分别取各实验菌液注入培养基中培养。稀释剂对照组取稀释剂加菌液注入培养基中培养。供试品对照组取供试液注入培养基中培养。通过3次独立的平行试验，分别计算各试验菌每次试验的回收率。采用观察大肠埃希菌、大肠菌群与阴性金黄色葡萄球菌在一样环境下的培养来验证控制菌的检查方法。结果：各试验菌的回收率均高于70%，稀释剂对5种试验菌的回收率均高于70%。结论：采用常规法可以进展本品的微生物限度检查。【关键词】黄连上清丸微生物

2、限度检查方法验证Abstratbjetive：TverifytheirrganisliitedinspetingethdfHuanglianShangqingpill.ethd：Plateuntingethdasusedtunt.Trailliquidandbaterialliquid，fivebaterialliquids，diluteliquidandbaterialliquid，trailliquidererespetivelyinjetedintultureediuftrialgrup，baterialliquidgrup，dilutinbilingualgrup，trailliqui

3、dntrlgrup.Everytrailreveryrateasalulatedinthreeindependenttrails.ThentrlbateriahekingethdasverifiedbybservingultivatinfEsherihiali，lifrandpsitivestaphybusaureusunderthesaeenvirnent.Result：Theratefeverytrailbateriaashigherthan70%，andtheratesffivedilutedtrailbateriaserehigherthan70%.nlusin：Theirrganis

4、liitedinspetingfHuanglianShangqingpillanbeused.KeyrdsHuanglianShangqingpill;irrganisliitedinspetingethd;verifiatin黄连上清丸具有散风清热、泻火止痛的成效，用于治疗风热上攻、肺胃热盛所致的头晕目眩、牙齿疼痛、口舌生疮等。其疗效确切，患者认可，并为中国药典2022年版收载。消费企业为了适应市场需要和方便患者服用，申请将大蜜丸改变为水丸。现根据中国药典2022年版要求，对非规定灭菌制剂及其原料、辅料进展微生物限度检查，同时进展方法学验证。为确保检验方法的准确性和可靠性，对该品种的微生物限

5、度检查进展了计数方法的验证及控制菌检查方法的验证，现将结果报道如下。1实验材料黄连上清丸由山西万辉制药消费,批号为20220708，20220709，20220710。菌种包括枯草芽孢杆菌B63501、金黄色葡萄球菌B26003、大肠埃希菌B44102、白色念珠菌F98001、黑曲霉F98003，由北京生物制品检定所提供1。培养基包括营养琼脂培养基20220920、营养肉汤培养基20220822、玫瑰红钠琼脂培养基20220118、改进马丁液体培养基20220215、改进马丁琼脂培养基20220125，均由北京奥博星生物科技有限责任公司提供。2实验方法2.1菌液的制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃

6、希菌、枯草芽孢杆菌的新颖培养物至10L营养肉汤中，3537培养18h24h，取此培养液1L加0.9%无菌氯化钠溶液9L，采用10倍递增稀释法，稀释至10-510-7，使菌数约为50100fu/L。接种白色念珠菌的新颖培养物至10L改进马丁液体培养基中，2328培养24h48h，取此培养液1L加0.9%无菌氯化钠溶液9L，采用10倍递增稀释法，稀释至10-410-5，使菌数约为50100fu/L。接种黑曲霉的新颖培养物至改进马丁琼脂培养基中，2328培养5d7d，加35L0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取1L菌液加0.9%无菌氯化钠溶液9L，采用10倍递增稀释法，稀释至10-410

7、-6，使菌数约为50100fu/L。以上菌液同时各取两份注入培养基培养。采用平皿计数法计数。结果见表1。2.2计数方法的验证2.2.1供试品溶液的制备取供试品10g，参加0.9%无菌氯化钠至100L，振摇，使成110的供试液。2.2.2黄连上清丸微生物限度检查回收率测定进展3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。试验组：取供试液1L，参加1L菌液50100fu/L，注入培养基。菌液组：分别取菌液1L，注入培养基。供试品对照组：取供试液1L，注入培养基。稀释剂对照组：取稀释剂0.9%无菌氯化钠1L，参加1L菌液50100fu/L，注入培养基。以上各组试验均同时做两份培养，且各试验

8、菌同时进展，采用平皿计数法。2.3控制菌检查方法的验证22.3.1大肠埃希菌32.3.1.1供试液的制备取供试品10g，参加0.9%无菌氯化钠至100L，振摇均匀，使其成为110的供试液未经高压蒸汽灭菌。转贴于论文联盟.ll.2.3.1.2验证方法试验组：取供试液10L，加到胆盐乳糖培养基100L中，作为供试品管。同法重复1份，参加大肠埃希菌76fu作为阳性对照管。另取与供试液等量的稀释剂加到胆盐乳糖培养基100L中作阴性对照管。3537培养18h24h，取上述增菌液0.2L，参加5L的4-甲基伞形酮葡糖苷培养基UG试管中，置3537培养5h24h，观察荧光，再参加靛基质试剂观察结果。阴性菌对

9、照组：采用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌。验证大肠埃希菌取胆盐乳糖培养基100L，按试验组同法操作，其中参加金黄色葡萄球菌75fu做阴性对照管。3537培养18h24h，取上述增菌液0.2L，参加含5L的UG试管中，3537培养5h24h，观察结果。2.3.2大肠菌群2.3.2.1供试液的制备取2.2.1项下的供试液1L，参加0.9%无菌氯化钠9L，即为1100的供试液，取1100的供试液1L，参加0.9%无菌氯化钠9L，即为11000的供试液。2.3.2.2验证方法试验组：取10L的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别参加110的供试液1L、1100的供试液1L、11000的供试液1L，作为供试品管。

10、同法重复1份，参加大肠埃希菌76fu作阳性对照管。另取与供试液等量的稀释剂加到10L的胆盐乳糖发酵培养基管中作阴性对照管。3537培养18h24h，观察结果。阴性菌对照组：验证大肠菌群，采用革兰氏阳性球菌金黄色葡萄球菌，取10L的胆盐乳糖发酵培养基管3支，按试验组同法操作，其中参加金黄色葡萄球菌75fu作阴性对照管。3537培养18h24h，观察结果。2.4统计方法供试品计数方法的验证检查进展3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。控制菌检查方法的验证采用与试验组和阴性菌对照组同法的操作。3结果3.1黄连上清丸微生物限度检查回收率测定结果见表2。由表可知该供试品对金黄色葡萄球菌

11、、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种试验菌的回收率均高于70%，稀释剂对5种试验菌的回收率均高于70%。3.2大肠埃希菌和大肠菌群控制菌检查结果见表3，表4。由表可见控制菌检查阳性菌生长良好，阴性菌均未检出。4讨论我们按照中国药典2022年版微生物限度检查法中常规法检验，首先将样品进展了细菌霉菌数测定，结果细菌数为4000fu/g，给方法学验证带来不便，故对制备好的供试液进展了高压蒸汽灭菌后再进展计数方法的验证。该供试品对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种试验菌的回收率均高于70%，稀释剂对5种试验菌的回收率均高于70%，故本品无抑菌作用。按照中国药典2022年版微生物限度检查法进展控制菌的方法学验证试验及检查。控制菌检查阳性菌生长良好，说明本品对大肠埃希菌、大肠菌群没有抑菌作用。阴性菌均未检出，说明该控制菌检查方法的专属性好，可用于控制菌检查。通过对本品的微生物限度检查计数方法的验证及控制菌检查方法的验证，在处方、消费工艺及检