降钙素基因相关肽在局灶性脑缺血再灌注大鼠脑内的表达

1、降钙素基因相关肽在局灶性脑缺血再灌注大鼠脑内的表达【摘要】目的：讨论GRP在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤时表达状况及其在损伤机制中的作用。方法：建立大鼠大脑中动脉缺血2小时再灌注24小时模型，分别采用TT染色及RT-PR法观察大鼠脑组织缺血状况及GRP的表达状况。结果：假手术组大鼠脑组织形态构造正常GRP呈弱表达；模型组大鼠大脑缺血区组织明显水肿，GRP表达较假手术组对应区显著升高，P0.05。结论：GRP参与了局灶性脑缺血再灌注损伤，且可能对缺血性脑损害起到一定的保护作用。【关键词】局灶性脑缺血再灌注大脑中动脉闭塞血红素加氧酶AstudynexpressinandsignifianefSTAT

2、3inerebraltissuesfRatafterfalerebralisheiaandreperfusin【Abstrat】bjetiveTinvestigatetheeffetsftheexpressinfGRPinerebraltissuesfratafterfalerebralisheiaandreperfusin.ethds2hursrightintraluinaliddleerebralarterylusinithreperfusinasinduedin20rats,andthespeienfbrainereperfredatthepintafter24hursreperfusi

3、n;expressinsfGRPeredetetedbyRT-PRethd.ResultsExpressinsfGRPereseensparselyinthentrlspeiens,anderearklyinreasedafertransientfalerebalisheiaandreperfusin(p0.05)nlusinExpressinfGRPisasignifiantrespnsettransientfalerebralisheia/reperfusinandntributesttheearlyfrasinfvasgeniedeathatanbebservedallparstfbra

4、ins.【Keyrds】falerebralisheia;reperfusin;heexygenase缺血性脑血管疾病是一种致死致残的常见并多发玻脑缺血再灌注损伤对脑损害的机制是非常复杂的。机制尚不非常清楚，更缺乏有效的治疗方法。降钙素基因相关肽GRP是由37个氨基酸组成的活性多肽，与降钙素为同种基因产物，是目前的体内最强的扩血管物质，广泛分布在脑组织中1，在缺氧缺血的脑组织中具有有效的细胞保护作用。鉴于此，本研究旨在建立大鼠大脑中动脉缺血2h再灌注24h模型后，通过RT-PR法检测大鼠脑组织GRPRNA表达的变化，讨论GRP在脑缺血再灌注损伤机制中的可能作用。1实验材料与方法1.1动物来源与

5、分组北京维通利华实验动物技术提供的SPF级雄性Sprague-Daley大鼠20只，体重260280g。将符合模型成功标准的大鼠随机分为假手术对照组5只；缺血组15只。假手术组按下术模型制备。1.2实验方法1.2.1脑缺血模型A制备参照Zea-lgue等复制局灶性脑缺血模型。将麻醉的大鼠仰卧位固定，颈正中切口，结扎并游离右侧颈总、颈外动脉，在游离段上接近颈内、外动脉分叉处剪开1小口，使4/0号外科尼龙线插入，经过颈总动脉分叉处进入颈内动脉，入颅至大脑中动脉起始处，线插入深度约为18.50.5。手术过程中保持环境在2530，且用棉垫和电烤灯维持大鼠体温于3737.5，并一直保持至动物麻醉清醒。造

6、模成功的标准：动物手术后有明显手术侧即右侧Hrner征右侧眼睑下垂，眼球凹陷及对侧偏瘫体症不能完全伸展左前肢，行走时向左侧倾倒或转圈2。依上述标准将可以存活24h的大鼠选定为最后的实验对象，并进展行为学评分。1.2.2取材再灌24小时后，在大鼠深度麻醉状态下取脑，距大脑前端4处及后端3处冠状取2厚的脑片，再迅速别离左右脑。用消毒好的锡箔纸包好右侧受损脑组织，立即放入液氮中冰冻，然后取出冻存于70的冰箱中。切下的脑片迅速置于TT皿中进展染色，来判断脑损伤的程度。1.2.3缺血区脑组织STAT3的表达按Trizl液的说明书提取总RNA。测定其浓度以及260n和280n处吸光度比值A260/280。

7、引物由大连宝生物工程合成，引物序列为：上游引物：5ATTGATGGATGTGATTTAATTA3；下游引物：5TAATGGGGAGGTAG3。总反响体系12L，30反响10in，42反响30in，99反响5in，5反响5in，DNA产物置于20保存。取5L逆转录反响液进展PR扩增，反响条件为94变性30s，55退火30s，72延伸1in，扩增28个循环，产物20保存。取PR产物5L经琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，拍照并用光密度仪扫描分析。通过-atin光密度值进展标准校正，计算GRPRNA的表达。转贴于论文联盟.ll.2统计学处理应用bandleaderver.3.0图像分析软件对PR电泳

8、图像进展分析，把图像信号转化为数字信号，再用SPSS13.0进展统计分析。实验数据采用t检验，P0.05，有统计学差异。3实验结果3.1脑缺血模型断定造模大鼠清醒后即呈现脑缺血表现，均出现不同程度Hrner综合征，左侧前后肢瘫，以前肢为重。3.2RT-PR结果RT-PR结果显示,经琼脂糖凝胶电泳可见GRP和-atin分别为387bp和329bp两条带。缺血大鼠脑内GRPRNA表达与假手术组有明显差异(P0.05)(图1)。假手术组与缺血24h组GRPRNA表达吸光度相对值(GRP/-atin)分别为:0.406、0.441、0.505、0.654、0.748、0.646。如图1。降钙素基因相关

9、肽是由37个氨基酸组成的活性多肽，具有扩张脑血管3、减少脑组织缺血性损伤4，对缺氧的神经元有保护和功能恢复等作用5。本实验中,首先TT染色结果显示假手术组脑组织构造正常；缺血再灌模型组大鼠缺血区脑组织明显变白,说明造模成功。其次,GRP在假手术组仅少量表达,而缺血组大鼠脑组织GRP表达均较假手术组对应区域显著升高。有实验报道GRP在脑组织中的表达对神经元有一定的的保护作用,但在缺血性脑损害中,GRP表达与其他应激性蛋白质在缺血性损害和修复过程中的机制及互相关系还不是很清楚，张天林等7比拟海马缺血及再灌流后现,GRP含量与A1、A2、A3和A4区凋亡细胞数呈显著性正相关。认为脑缺血及再灌流后GR

10、P增加虽有可能增加脑供血,但也可能触发再灌流损伤的发生,而导致神经元凋亡。因此GRP在脑缺血及再灌流中所起的作用较为复杂，有必要深化研究。【参考文献】1KressA,TabitzD,SkfitshG,DetailedappingfGRPrnaexpressinintheratntralnervussyste:parisnithpreviusiunyt-heialfindings.BrainResBull1995,36(3):261.2atsuY,Izuiyaa,nderaH,etal.EffetfanvalthrbxaneA2reeptrantagnist,S-1452,npstisheiinjuryintats.Strde,1993,24:2059.3JhnstnFG,BellBA,RbertsnIJ,Effetfalitnin-gine-relatedpeptidenpstperativeneurlgialdefiitsaftersubarahnidhaerrhageJ.Lanet,1990,335:869872.4HllandJP,SydserffSG,TaylrAS,e