蒿鳖养阴软坚方对四氯化碳所致肝纤维化的治疗作用研究

1、蒿鳖养阴软坚方对四氯化碳所致肝纤维化的治疗作用研究孔维涵，郝洁，方步武，张永进，邢伟，刘洁莹，凌宁生，张玉萍，崔志清【摘要】目的探究蒿鳖养阴软坚方治疗l4等所致肝纤维化的作用。要领0.5ll4/100gt皮下注射16次(后15次注射用l4橄榄油=46,V/V)辅以10%乙醇为饮料制备肝纤维化模子，成模后以蒿鳖养阴软坚方治疗，灌胃用药24.48g/kg(生药/体重)和8.16g/kg，每周6d2个月。效果8.16g/kg蒿鳖养阴软坚方能显着低落肝纤维化大鼠肝构造胶原卵白含量及血清透明质酸和IV型胶原(P0.05)。结论蒿鳖养阴软坚方具有治疗l4等所致肝纤维化的作用。【关键词】四氯化碳所致肝纤维化

2、蒿鳖养阴软坚方治疗作用胶原纤维羟脯氨酸透明质酸IV型胶原TheEffetfHa-bieYangyinRuanjianPresriptininTreatingHepatiFibrsisausedbyl4Keyrds：arbntetrahlride;Hepatifibrsis;Ha-bieYangyinRuanjianPresriptin;Therapeutieffet;llagenusfiber;Hydrxyprline;Hyalurniaid;Type-IVllagen肝纤维化存在于种种慢性肝病的发病历程中，发病率高。慢性肝病运动期(如慢性运动型肝炎、运动期肝硬化、慢性重症肝炎)通常出现阴虚血

3、淤证型，且病情较重、治疗较难。临床盛行病学视察1效果表现，阴虚血淤是肝炎后肝硬化最常见的证型之一，有阴虚兼证的占47.04%(135/287)。而如今上市的抗肝纤维化药物险些均以益气活血法为主组方，不宜用于阴虚血瘀证型。蒿鳖养阴软坚方为方步武领悟?温病条辨?青蒿鳖甲汤方义、朱起贵传授治疗慢性肝病的用药履历和当代药理研究的效果等创制的一首方剂。该方以养阴活血软坚、凉血清热解毒法组方，由青蒿、鳖甲、知母、生地、丹参、虎杖、白花蛇舌草等9味药构成，用于治疗阴虚血淤、血热毒蕴的肝纤维化。本研究接纳l4等制备肝纤维化模子，成模后以该方的粗提物治疗，以明白蒿鳖养阴软坚方治疗肝纤维化的作用，为其临床应用与进

4、一步研发提供实行根据。1质料与仪器1.1动物SPF级istar大鼠46只，牝牡各半，体重220240g，由军事医学科学院实行动物中心提供，动物及格证号：SXK-军2002-001。豢养于天津医科大学实行动物中心，自由进食水。1.2药品先将鳖甲煎煮2h，参加其他八味药材，6倍量水提取1次，1h/次；将药渣晾干，用60乙醇6倍量提取2次，0.5h/次。归并滤液，接纳乙醇，浓缩样品液，定容至所需浓度(含生药2g/l)。在中新药业天津乐仁堂制药厂和天津隆顺荣制药厂提龋1.3试剂L-羟脯氨酸，电泳纯，上海康达氨基酸厂消费，批号920506；对二甲氨基苯甲醛，阐发纯，天津化学试剂研究所消费，批号20020

5、322；高氯酸，优级纯，天津市化学试剂一厂消费，批号20220229；橄榄油，化学纯，北京化学试剂公司消费，批号：69018028；四氯化碳，阐发纯，天津大学科威公司消费，批号20221028；甲醛溶液，阐发纯，天津市化学试剂六厂消费，批号20220912；透明质酸(HA)和IV型胶原(IV-)放射免疫阐发试剂盒由天津九鼎医门生物工程提供；III型胶原(III-)放射免疫阐发试剂盒为上海海研医门生物技能产物，批号20220401；其他均为市售阐发纯试剂。1.4仪器VIS-7220紫外可见分光光度计，北京瑞利阐发仪器公司消费；光学显微镜，日本lypus公司消费。2要领2.1模子制备对iyazak

6、i要领2略加修改：按体重随机区组分组法，随机取8只大鼠为正常比较组(正常组，此中1只换垫料时跑掉)，别的大鼠用于造模。造模第1次四肢皮下注射l40.5l/100g体重，以后每隔3天四肢皮下注射l4橄榄油溶液l4橄榄油=46,V/V0.5l/100g体重，共注射16次，平常以10%乙醇为唯一饮料，但注射前一天暂时改为清洁自来水为饮料，注射后再立即改为10%乙醇。造模时不消玉米面、猪油、胆固醇，而用大鼠尺度饲料。正常组大鼠不可造模处置惩罚。2.2分组与给药造模45天后，随机取8只造模鼠(短模组)，经肝构造羟脯氨酸(hydrxyprline,Hyp)含量测定与肝构造形态学不雅察证明肝纤维化形成。对别

7、的造模鼠按体重随机区组分组法分为3组：模子比较组(长模组)、蒿鳖养阴软坚方大剂量组、蒿鳖养阴软坚方小剂量组(临床等效剂量组)。造模乐成后开始治疗用药：蒿鳖养阴软坚方大、小剂量组别离天天灌胃24.48g/kg和8.16g/kg，体积均为13l/kg，1次/d，每周用药6d，一连2个月。正常比较组和长模组灌胃等体积蒸馏水。末了1次灌胃竣事24h后，大鼠以水合氯醛麻醉，仰卧位剖腹，腹腔静脉取血，分散血清，-20保存。取肝构造别离以10%中性甲醛结实及入氯仿甲醇(21,V/V)的液体中脱水脱脂。2.3指标检测接纳Jaall法，将Hyp(g/g)乘以系数22.38(6000/507.46/40)(g/g

8、=g/g，胶原卵白/肝干粉)。III型胶原(PIIIP)、IV型胶原(IV-)、透明质酸(HA)接纳放射免疫阐发法，见试剂盒说明。通例白腊切片，HE染色和胶原染色，光镜不雅察。肝纤维化程度分期尺度参照文献3，分为0，1，2，3，4期：无，为0期；汇管区扩大,纤维化，为1期；汇管区四周纤维化,纤维隔形成,小叶布局保存，为2期；纤维隔伴小叶布局紊乱,无肝硬化，为3期；早期肝硬化或必定的肝硬化，为4期。2.4统计阐发计量资料表现为s，接纳SPSS8.0统计软件，两组间比力用t查验，多组间比力用单因素方差阐发，此中每两组间比力在方差齐性时用LSD查验而方差不齐时用Tahane查验。半定量资料接纳Rid

9、it阐发。3效果3.1一样平常环境正常组大鼠生长精良，皮毛柔顺有光芒，生动好动，饮食正常；模子组大鼠精力差，运动少，皮毛败坏无光芒；治疗组大鼠皮毛少光芒，但精力较好。3.4肝构造病理形态变革镜下不雅察：正常组大鼠肝构造可见肝板以中心静脉为中心呈条索状向附近放射样摆列，板间有不规矩肝窦，肝小叶内网状纤维支架布局完备，汇管区无扩大，无纤维构造增生和炎性细胞浸润；肝纤维化模子组大鼠肝小叶布局粉碎，纤维构造增生显着，将肝小叶分开成巨细不等的肝细胞团，肝细胞变性坏死，并可见假小叶形成，汇管区扩大，胶原沉积；治疗组肝细胞的变性坏死程度及肝小叶布局粉碎程度低落，肝胶原纤维增生亦显着减轻，纤维条索疏松变窄。模

10、子组的肝纤维化程度分期明显高于正常组P0.01，各治疗组的纤维化程度均有所减落，但未见统计学差异。见表1及图14。4讨论4.1l4致大鼠肝纤维化模子形成通过肝构造胶原卵白含量、血清肝纤维化标记物(HA、IV-等)和肝构造形态学变革等定量、定性指标判断，本研究所接纳的l4等可致大鼠肝纤维化模子形成。本文肝构造胶原卵白含量是通过所测定的Hyp换算出来的，Hyp是构成机体胶原卵白的一种特有的氨基酸，除外弹性卵白含少量Hyp(约1%)，险些全部Hyp均存在于胶原，因此其能定量反响肝纤维化的程度。同时造模组肝脏纤维构造增生明显，可见假小叶形成。与韩德五传授的模要领差异的是未利用玉米面、猪油、胆固醇，而用

11、大鼠尺度块料；仅用10%酒精为饮料，且在注射前一天下战书17:00时摆布改用清洁水为饮料，注射后又立即规复用10%酒精为饮料，这些方法可低落造模大鼠的殒命率，更轻便，同样可引起肝纤维化(虽其程度稍轻)。造模历程中大鼠殒命4只，此中1只为天然殒命(瘦弱、纤维化程度重)，别的3只因捉拿时用力过大而死。l4是强力的肝毒剂，如今以为l4通过氧化应激(产生自由基、引发由X介导的炎症反响、导致肝星状细胞活化)、加强细胞因子(TGF1、TNF、ILs等)活性和引起体内相干酶系变革(ALT、AST、YP450活性升高)而引起肝损伤4，这些均为肝纤维化产生的紧张机制；一连利用少量乙醇可诱导YP450酶，该酶在l

12、4引起的肝纤维化历程中起着紧张作用。4.2蒿鳖养阴软坚方具有治疗l4所致大鼠肝纤维化的作用由于这里的造模仅用l4、酒精，未加用猪油、胆固醇、玉米面，慢性肝损伤略轻；同时接纳治疗给药，一那么因实行周期较长，l4所致肝纤维化有自行汲取倾向(终究上这是以l4为重要损伤因素诱导肝纤维化模子的配合不敷)，二那么治疗肝纤维化较之防范的难度大，但只管云云，蒿鳖养阴软坚方仍具有精良的治疗l4所致大鼠肝纤维化的作用，表现为能显着低落肝构造胶原卵白含量及血清HA和IV-水同等公认的肝纤维化指标。也不雅察到蒿鳖养阴软坚方大剂量组(24.48g/kg)的疗效不及小剂量组(8.16g/kg)，这里的小剂量即临床等效剂量，一方面提示对慢性肝病的药物治疗要留意接纳符合的剂量，另一方面说明该研究的效果对临床用药有紧张的引导意义、剂量方案是公正的，为进一步研发奠基了精良的基矗总之，本研究所方案的l4为主并用少量乙醇的造模方案引起了明白的肝纤维化病变，蒿鳖养阴软坚方粗提物在成模后用药具有治疗l4等所致肝纤维化的作用，其作用机理有待进一步探究。【参考文献】1张琴，张文彤，魏建军，等.公因子和聚类阐发团结在肝炎后肝硬化证候分类研究中的应用J.中西医团结学报，2022,3(1):14.2iyazakiT,Karube,atsuzakiY,etal.Taurineinhib