冰城链霉菌属间接合转移体系的构建

1、科技创新实验论文冰城链霉菌属间接合转移体系的构建学生：邢月超、姚萌、白晶芝、丁秀云单位：生命科学学院指导教师：向文胜2012年9月23日冰城链霉菌属间接合转移体系的构建摘要：本次试验采用的冰城链霉菌是从土壤中分离筛选得到的一株新的吸水链霉菌菌 株，它能代谢产生米尔贝霉素，本次试验对于冰城链霉菌-大肠杆菌属间接合转移体系的构 建方法条件进行了初步的摸索和优化，对于后续基因的转移等相关实验内容奠定了基础，便 于后续相关操作的进行。关键词：冰城链霉菌;大肠杆菌;属间接合;异源表达刖言1.1冰城链霉菌简介冰城链霉菌（StreptomycesbingchenggensiS是由向文胜实验室从中国哈尔滨土壤

2、中 分离筛选得到的一株新的吸水链霉菌菌株，并对该菌株进行了形态特征、培养特征、生理生 化特征、细胞壁化学成分及16S rDNA序列（DQ449953）等鉴定（Wang等，2009a； Xiang 等，2007a），通过与其它菌株进行比较，鉴定其是一新种链霉菌。在高氏培养基表面冰城链霉菌生长紧密，随着时间的推移菌落颜色逐渐变深，有白色最 终变成灰色。油镜下观察基丝分枝，无横隔，不断裂；气丝分枝较多，较基丝粗？：成熟的 菌丝直径为0.8-1.2 um,抱子丝为3-8圈紧密螺旋。通过电镜观察抱子呈卵圆形，表面有 明显的疣。冰城链霉菌的线性染色体长度11936683 bp,菌内没有质粒存在，G+C含量

3、为70.8%, 这是迄今为止公布的较大的细菌基因组之一。染色体上分为三个区域：7.2 Mb的核心区域， 1.5 Mb的左臂和3.2 Mb的右臂。通过分析，其上有10023个预测的蛋白编码序列，其中6 419个具有可知的或者潜在的功能。83%的基因分布在核心区域，许多与次级代谢有关的基 因则分布在两臂上。初步数据分析，冰城链霉菌基因组上至少含有23个与聚酮化合物、非 核糖体多肽和萜生物合成有关的基因簇。其中的14个基因簇定位在染色体右臂，包括米尔 贝霉素和冰城霉素；南昌霉素和其他5中？隐藏的基因簇位于染色体核心区域（Wang等， 2010a）。冰城链霉菌的代谢产物具有杀虫活性，实验表明该链霉菌能

4、够产生对叶蜡、蚜类等具有 高效防治能力的抗生素（Xiang 等，2007b； Wang 等，2009b； Wang 等，2010b； Xu 等，2010）。 该菌发酵液的结晶产物通过核磁共振和质谱的鉴定，含有米尔贝霉素、南昌霉素、冰城霉素 A和冰城霉素氏其中包括具有较高商业价值的米尔贝霉素A3和A4组分及10个新颖的米尔 贝霉素类似物（高爱丽等，2007）。1983年米尔贝霉素A3和A4组份的混合物被用做杀螨剂， 被美国环境局推荐为对环境友好的杀虫杀螨剂（王则等，2009）。1.2大肠杆菌-链霉菌属间接合转移Trien-Cuot等（1987）阐明了通过属间接合转移将质粒从大肠杆菌向一些革兰氏阳

5、性菌 转移的可行性，随后大肠杆菌-链霉菌属间接合转移的方法也得以建立。由于很多链霉菌 的原生质体转化系统难以建立,大肠杆菌-链霉菌属间接合转移技术得到了日益广泛的应用。用于大肠杆菌-链霉菌属间接合转移的质粒应该携带以下元件:大肠杆菌质粒复制子、来 自大肠杆菌IncP质粒RK2/RP4的转移起始位点oriT、能在大肠杆菌和链霉菌中进行筛选的 抗生素抗性基因。接合转移的发生还需要一些反式作用因子的参与，因此要将携带目的基因 的待转移质粒转化进能编码这些反式作用因子的大肠杆菌宿主中，这样，携带目的基因的待 转移质粒就可以在反式作用因子的辅助下，从oriT开始以滚环复制的方式从大肠杆菌向链 霉菌转移。

6、大肠杆菌-链霉菌属间接合转移具有以下一些优点:首先，操作相对简便，不依赖于宿主 菌原生质体的制备和再生技术；再者，接合转移过程中，质粒以单链的形式进入宿主菌，基 本避免了链霉菌宿主限制系统对外源DNA进入细胞造成的障碍；最后，接合转移实验中使用 的载体可以在大肠杆菌中复制，因而前期的克隆构建操作也相应简便。1.3立题依据及意义本次试验采用的冰城链霉菌是从土壤中分离筛选得到的一株新的吸水链霉菌菌株，它能 代谢产生米尔贝霉素。大肠杆菌-冰城链霉菌属间接合转移体系的构建对后续实验有很大帮 助。将具有调控作用、与冰城链霉菌相关模块结构或功能类似的基因导入质粒中，通过属间 接合转移的方法将质粒导入冰城链

7、霉菌中，可以将冰城链霉菌中相关基因替换或改造，从而 可能产生具有新性状的化合物，或提高原有产物的产量。因此，探索大肠杆菌-冰城链霉菌 属间接合转移体系的条件，具有重要意义。实验材料和仪器2.1菌种及质粒菌种为大肠杆菌和冰城链霉菌。（均由向文胜老师提供）质粒为 pIJ8600（aac（3）IV, tsr, ori pUC18,oriT/RK2, tipAp, FC31 int/attPi et al， 1999）2.2培养基（1）LB 养基:胰蛋白胨 1g，酵母粉 0.5g, NaCl 1g，蒸馏水 100ml，pH7.2-7.5。（2）LA培养基:取LB液体培养基，每100ml加入1.5g琼脂

8、粉。（3）MS培养基:2g黄豆饼粉，煮1.5h,过滤取滤液，2g异丙醇，2g琼脂，定容至100ml。（4）2xYT培养基:胰蛋白胨1.6g，酵母粉1g, NaCl 0.5g，蒸馏水l00ml。（5）燕麦培养基:燕麦粉煮30min取滤液，微量元素溶液1ml，琼脂15g，蒸馏水l000ml， pH7.2。微量元素溶液：FeS0.7H0 0.1g，MnCl.4 HO 0.1g，ZnSO .7H O 0.1g,蒸馏水 l00ml。42242（6）GTY培养基（在高氏一号培养基基础上改良而来）：可溶性淀粉2g，NaCl 0.05g， MgSO.7HO 0.05g，KNO 0.1g，K HPO 0.05g

9、，FeSO .7H O 0.001g，酵母膏 0.2g，蛋白胨42324420.4g，葡萄糖1g,琼脂2g，蒸馏水100ml，终pH在7.2-7.4之间。（其中可溶性淀粉是用 沸水溶的）2.3化学试剂（1）MgCl （2.5mol/ml） :5.08g MgCl?溶于 10ml 蒸馏水中。（2） 实验用到抗生素如下：2表1抗生素及其使用浓度抗生素英文名称和缩写贮藏浓度（mg/ml）使用终浓度（“ g/ml）卡那霉素Kanamycin,Km2525氯霉素Chloramphenicol,Cml2525氨苄青霉素Ampicillin,Amp100100硫链丝菌素Thiostrepton,Tsr251

10、2萘啶酮酸Nalidixic acid,nal2512502.4主要实验仪器离心机（德国Sigma）、电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）、超低温冰箱（美国 HARRIS公司）和超净工作台（苏净集团安泰公司）、凝胶成像系统（上海天能科技有限公司） 等。实验方法以下关于链霉菌菌株的操作、质粒转化、属间接合转移的方法等参见链霉菌遗传操作手 册（D.A.Hopwood）。3.1菌株培养及保藏本实验室采用液体培养基LB培养大肠杆菌。大肠杆菌菌种保藏采用低温甘油保藏法。 离心收集大肠杆菌过夜培养物，去掉上清培养基，加入20%的无菌甘油（新配制的甘油，湿 热灭菌两次），或将菌液与40%的无菌甘油1:1混

11、合，然后置于-20C保存。培养链霉菌常用MS琼脂培养基。链霉菌抱子保藏的方法如下:用无菌棉签轻轻刮取产孢丰富 的平板上的抱子，在20%的甘油中洗涤，或用无菌水洗涤抱子斜面，用接种环轻刮，使抱子 混入水中，再振荡均匀，用抱子过滤器过滤除去菌丝体，离心收集抱子加入终浓度为20%的 甘油，置于-20 C保存。3.2 pIJ8600转化大肠杆菌在新鲜平板上挑取的大肠杆菌单菌落接入100mlLB培养基中，用37C摇床培养3h,直 到测OD值为0.35，立即置于冰中冷却1 Omin，然后将细胞应置于4C离心机中，4000rpm600离心10min，弃去上清液，每50ml初始培养物用30ml预冷的0.1 m

12、ol/L CaC*重悬细胞， 在冰上放置15-30 min，4000rpm,4C离心10min,弃去上清液，每50 ml初始培养物加入2 ml预冷的0.1 mol/L CaCl?重悬，在冰上贮存。取大肠杆菌感受态细胞100p l,加入待转化质粒（小于20p l），混匀，冰上放置30min 后,42C水浴，热激90s，冰上放置2-10min,加400|j l LB培养基，在37C摇床温和摇动， 温育45 min至1h,使细胞复苏,4000rpm离心3min，弃300 |J l上清，重新使菌悬浮，取100 M l涂布于含有氨苄青霉素的LA平板，于37C倒置培养12-l6h以后可观察到转化子。挑选转

13、化子在抗性平板上传代2-3次，确定质粒可以稳定遗传，按2.2.1中方法保藏。3.3质粒验证在进行属间接合转移实验前应对大肠杆菌提质粒验证质粒是否丢失。具体操作步骤按照 质粒提取试剂盒说明书进行。挑单菌落37 C，250r过夜培养，提质粒。（1）取1.5-4.5 ml过夜培养的菌液，9000 rpm,离心30 s,弃上清，收集菌体，尽可 能的倒干上清；（处理超过1.5 ml菌液可以离心弃上清后，在同一个1.5 ml管内加入更 多的菌液，重复步骤（1）,直到收集到足够的菌体。）（2）用250 M溶液P1重悬菌体沉淀，漩涡震荡至彻底悬浮；（如有未彻底混匀的菌块, 会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。加

14、250 M溶液P2,温和地上下翻转6-10次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮； (温和的混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂，所用时不应超过5 min,以免质粒收到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可做下一步。)加400 M溶液P3,立即温和地上下翻转6-10次，室温放置5 min，室温13,000 rpm离心10 min，小心取上清;将吸附柱安装到收集管，加入500 M溶液P4,室温13,000 rpm离心1 min，弃滤 液；将上一步所得上清液加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)，13,000 rpm离心1 min， 弃滤液；加入500 M去蛋白液PE，1

15、3,000 rpm离心30-60s，弃滤液;(此步骤为了除去痕 量核酸酶等杂质，如所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量丰 富，应加此步骤；如所用菌株为XL-1Blue和DH5a等缺陷菌株，核酸酶含量低，则可略过此 步骤。)加入500 M漂洗液WB，13,000 rpm离心30-60 s,弃滤液；重复步骤(7) 一次，13,000 rpm离心30-60 s,弃滤液。空柱13,000 rpm离心2 min。 室温放置3-5分钟，除去残留乙醇。取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加60-100 M洗脱 缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65C水浴中温热

16、)，室温放置1 min, 13,000 rpm离心1 min 洗脱DNA，可立即用于下游分子生物学实验或-20 C保存。(洗脱体积越大，洗脱效率越高， 如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应小于50 体积过小 降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。将洗脱的质粒进行酶凝胶电泳操作，看是否存在目的质粒。3.4属间接合转移受体制备：取培养7天的冰城链霉菌斜面，加适量灭菌去离子水，刮抱子于带玻 璃珠的150ml三角瓶中(每个三角瓶刮3个斜面)；在250rpm,28C, 20min,将抱子打散； 过滤，用等体积2xYT洗两次，6000rpm,10min,收集抱子；将抱子悬浮于适量2xYT

17、中，50C 热激10min (设置未热激的进行对照)；28C,250rpm,预萌发1.5-2h,备用。(将抱子做梯度 稀释涂平板，通过计数菌落数换算出抱子浓度)供体制备：已将pIJ8600转入大肠杆菌并保藏，从保藏菌株中取3p l接种于3ml LB培养基中，并在培养基中加入Kan、Chl、Amp, 250rpm , 37C过夜培养；取500p l菌液 接种于 25mlLB (加入 Kan、Chl、Amp)中,250rpm , 37C培养至 OD 到适宜值；4000rpm,60010mim,收集大肠杆菌，用等体积LB洗菌两次后悬浮于适量LB中。属间接合转移：按一定供受体比例(10:1,1:1,1

18、:10,1:100)混合大肠杆菌和链霉 菌抱子，3000rpm, 10min,去上清，用残留液体悬浮，涂板于加入MgCl? (10mM/L)的MS培 养基中，28C培养；在分别培养10、11、12、13、14、15h后用含有1.25p g萘啶酮酸和 12.5p g硫链丝菌素的1ml蒸馏水涂布平板，风干后继续培养4-5天可观察结果。3.5接合子验证培养5-6天后挑选接合子到含硫链丝菌素和萘啶酮酸的MS平板上进行验证和二次验证, 确定pIJ8600已导入阿维链霉菌中。实验结果4.1冰城链霉菌抱子萌发率与热激的温度的时间的结果以新制备的不经过任何处理的冰城链霉菌抱子为萌发率100%对照组，不同温度和

19、时间 的热激处理对抱子萌发的影响如图4-1所示。可以看出，温度梯度为30 C、40 C、45 C、 50 C、55 C时，在同一温度下，随着时间的延长，抱子的萌发率逐渐下降，抱子萌发率最 高不超过对照组的30%；在同一处理时间下，随着温度的升高，抱子的萌发率依次下降。但 是经过35 C热激时，抱子萌发率的变化趋势有所不同，5 min至20 min的热激处理过程中， 抱子只能维持20%以上的萌发率，尤其在10 min时，抱子的萌发率最高达也只到了 72.7%。 即冰城链霉菌对高温热激处理很敏感，抱子的萌发率显著下降。80激对冰城链霉菌抱子萌发的影响日()oFIuowumLsgJods-3or-4

20、35T80激对冰城链霉菌抱子萌发的影响日()oFIuowumLsgJods-3or-435T-4or-4srf-5crc-*-55 r属间接合转移系统的建立4.2.1大肠菌种-冰城链霉菌226541属间接合转移条件的探索本研究以大肠杆菌-链霉菌整 合质粒pIJ8600 (图4-3)为待转 移质粒，首先将PIJ8600转入 ET12567(pUZ8002)中，然后进行接 合转移实验。初步优化了质粒 PIJ8600 从大肠杆菌 ET12567(pUZ8002)向冰城链霉菌 226541发生转移所需的适宜条件。所用的质粒含有oriT，转移起始点；tsr，硫链丝菌素抗性基因；aac(3)IV阿泊拉霉

21、素抗性基因；attP,噬菌体 C31整合位点；int q C31，噬菌体Q C31整合酶基因。pIJ8600 整合型质粒，具有0 C31的attP和int, RK2的oriT，aac(3)IV和tsr在链霉菌和大肠杆图 4-3 pIJ8600 图 4-3 pIJ8600 图谱4.2.2接合转移培养基的选择选用多种培养基培养冰城链霉菌，根据菌体在其上生长情况决定选择MS培养基作为冰 城链霉菌的固体产抱培养基。进行属间接合转移时，培养基是否合适对于实验的成功与否有 着决定性的影响。在本实验接合转移过程中尝试使用三种不同的培养基进行大肠杆菌 ET12567（pIJ8600）-冰城链霉菌属间接合转移实

22、验，三种培养基分别为：GTY （阿维链霉菌接 合转移培养基）、改良高氏一号（阿维链霉菌接合转移培养基）和MS （玫瑰黄链霉菌接合转 移培养基），实验结果显示在改良高氏一号培养基和MS培养基上有接合子生长，而MS培养 基的效果比较显著。（表4-2） 表4-2属间接合转移培养基的选择 固体培养基接合转移的结果 TOC o 1-5 h z GTY-改良高氏一号+MS +注：-表示无接合转移子；+表示有接合转移子；+表示 有较多接合转移子4.2.3大肠杆菌-冰城链霉菌226541属间接合转移的操作程序将 pIJ8600 转入大肠杆菌 ET12567（pIJ8600）在 LB中过夜培养，培养物1:50的

23、比例转接于新鲜的LB培养基，培养至OD为0.5时收集菌体，等体积LB洗涤两600次，4 000 rpm 10 min， 1/10体积LB悬浮待用。从斜 面培养基上刮取新鲜的冰城链霉菌226541抱子于2XYT 中，洗涤一次，6 000 rpm，10 min，悬浮于2XYT中，28 C预萌发处理30分钟，取10 M l抱子悬液稀释涂板计数，换算成抱子悬液中抱子数/ml。取大肠杆菌和抱子悬液各500 |J l， 3 000 rpm，离心10 min混合，倒上清，用残液悬涂布于含有30 mM MgCl?的接合转 移培养基。培养20小时，用含有1.5 mg萘啶酮酸和适当浓度的抗生素的1 ml无菌水均匀

24、 覆盖平板表面。风干后，继续28 C培养4-5天出现接合转移子。图4-7冰城链霉菌BC-86004.2.4供体和受体比例的确定在大肠杆菌ET12567（pIJ8600）-冰城链霉菌的属间接合转移中，供体菌和受体菌混合培养时会相互竞争，而且由于链霉菌的生长速度明显慢于大肠杆菌ET12567,如果作为供体的大肠杆菌用量过大，冰城链霉菌就难以生长，使接合转移的频率显著下降甚至失败，在实验中遇到过此现象。在使用1010个/ml冰城链霉菌抱子的条件下，本实验探讨了适宜的大肠杆菌用量，结果表明在本实验条件下，作为供体的大肠杆菌细胞OD值为0.5时，pIJ8600从600大肠杆菌向冰城链霉菌的转移频率最高，

25、能够接近10-7 （表4-3）,此时大肠杆菌的数量为 109个/ml，供体与受体的比例为1:10,与相关文献报道相符。表4-3供体菌细胞数量对接合转移频率的影响受体抱子量含pIJ8600的大肠杆菌的接合转移频率（10-8）OD 值10100.12.6210100.23.2610100.33.7010100.44.7410100.59.6010100.65.404.2.5抗生素的使用量及覆盖时机对接合转移频率的影响萘啶酮酸和硫链丝菌素的使 用量及覆盖时间影响着大肠杆 菌-冰城链霉菌属间接合转移的 频率。抱子和大肠杆菌混合涂布 在接合转移平板后，在PUZ8002 的辅助下，PIJ8600进入冰城链

26、 霉菌的抱子与其基因组进行整 合。覆盖抗生素的时间过早，接 合转移不完全，而且基内菌丝生 长不牢固，抗生素覆盖时菌丝容 易被刮掉；时间过晚，大肠杆菌 的生长会抑制抱子的正常生长，2 0 8 6 4 2 01 1-GoI) Aouunbu.g UOIJEOC=UOOSUEH1618202224Antibiotic coverage tune after mixture spores and E.coli (hour)菌丝体和大肠杆菌容易混在一起，难于分辨单菌落。因此应该选择一个合适的时间在培养基 上覆盖抗生素，既能保证PIJ8600顺利地进入冰城链霉菌，又能不让大肠杆菌阻碍链霉菌的 生长。选择硫

27、链丝菌素的使用浓度为15p g/ml，萘啶酮酸的使用浓度为60p g/ml2 0 8 6 4 2 01 1-GoI) Aouunbu.g UOIJEOC=UOOSUEH1618202224Antibiotic coverage tune after mixture spores and E.coli (hour)盖抗生素的时机对接合转移频率的影响结果分析链霉菌能产生多种抗生素和生物活性物质，其自身基因转移系统的建立是进行抗生素合 成基因功能性鉴定、分析和其它遗传操作的前提，可对抗生素生物合成基因簇中单个基因进 行功能分析，可对亲本宿主中的该基因进行破坏或置换，然后观察和检测基因被破坏后亲本 菌

28、株产生抗生素的变化情况，因此建立宿主自身的基因转移系统是必不可少的。自从Trien-Cuot等(1987)阐明了通过属间接合转移将质粒从大肠杆菌向一些革兰氏 阳性细菌转移的可行性，随后大肠杆菌-链霉菌属间接合转移的方法也得以建立。目前这种 技术得到了日益广泛的应用，这种跨属的质粒转移方法为某些难以用常规方法进行DNA转化 的链霉菌和其它放线菌属的遗传操作提供了重要手段。以下几点优势使其应用越来越广泛: 首先，操作相对简便，不依赖于宿主菌原生质体的制备和再生技术；其次，一系列含有转移 起始位点(oriT)的载体可以位点特异性整合或直接插入染色体上；再次，接合转移实验中 使用的载体可以在大肠杆菌中

29、复制，因而前期的克隆构建操作也相应简便。接合转移作用依赖于顺式作用的oriT和IncP群质粒RK4以反式方式提供转移基因 的转移功能，程序相对简单，宿主范围广泛。通过非甲基化供体菌能消除甲基化影响，显著 提高基因导入效率，大肠杆菌ET12567就是非甲基化供体菌。大肠杆菌-链霉菌接合转移是 通过细胞之间物理接触，质粒转移至目的链霉菌中。链霉菌是一个高度分化的菌属，不同菌 种之间有很大的差异，适用于一种链霉菌的转化方法不一定适用于其它链霉菌，即使同一种 链霉菌的不同菌株由于遗传背景的不同，转化效率也差别很大，而且不是每一种链霉菌都能 够进行转化，因此需要根据目的菌株的情况，探索适合的转化方法。在

30、本实验中，从不同的角度对大肠杆菌-冰城链霉菌属间接合转移条件进行了优化，最 终使PIJ8600向冰城链霉菌226541中转移的接合转移频率达到了 1.13X10-7。但是这个接 合转移频率在已经报道的用此方法操作的链霉菌中并不算高？，如St rep tomyces rimosus 的接合转移频率可以达到10-2, Kitasatospora setae的接合转移频率可以达到10-6。在本 研究中也做了 St rep tomyces lividans TK24的属间接合转移实验，同样条件下， St rep tomyces lividansTK24的接合转移率能够达到为10-3，这是由于St re

31、p to myceslividansTK24体内缺少甲基化限制系统，外源DNA能够比较容易进入其细胞内，也正是由 于这一优点，St rep tomyces lividansTK24被用作大片段DNA或基因簇的模式表达菌株。许多大肠杆菌-链霉菌属间接合转移实验中，都需要对链霉菌的抱子进行热激处理，一 般为50 C热激10 min。这样处理的目的是通过热激去除链霉菌抱子表面的DNase，使得外 源DNA容易进入抱子中。然后经过适合链霉菌抱子萌发的条件处理抱子，使之萌发出抱子管， 易于接受外源质粒。然而并不是所有的链霉菌抱子都适合高温热激处理，对于不耐高温的菌株，热激的处理 会使抱子的死亡率严重升高，不利于后续的实验，所以就需要探索一条比较适合链霉菌抱子 特性的路线，以补偿未经热激处理接合转移频率的损失量。如St rep to mycesspp.在属间接 合转移实验中，尝试了从29 C到37 C的温度梯度实验，结果显示37 C条件处理下接合 转移效率最高。从图4-1可以看出，冰城链霉菌就属于对热敏感的链霉菌菌株，所以在本实 验中省去了热激处理这一步骤，直接进行适合冰城链霉菌抱子的预萌发处理，最终确定条件 为28