槲皮素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

1、PAGE 10 -槲皮素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用林雪梅王小林唐春红摘要目的探討棚皮素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法将54只雄性SD大鼠随机分成三组：假手术组、缺血再灌注组、缺血再灌注+棚皮素组。采用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻断局灶性脑缺血模型，缺血2h，再灌注24h;假手术组仅暴露左侧颈总动脉后缝合。缺血再灌注+棚皮素组大鼠在缺血30min后腹腔注射棚皮素50mg/kg，假手术组及缺血再灌注组大鼠按相同方式给予等体积溶剂。再灌注24h后评价大鼠神经功能状态、脑组织含水量，观察脑组织形态学变化，制备脑组织匀浆并测定脑组织超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MD

2、A）含量。结果腹腔注射棚皮素后，大鼠神经功能评分降低、脑组织含水量下降、脑组织内SOD活性增加、MDA含量降低、脑组织损害减轻，差异有统计学意义（P0.05）。结论棚皮素可通过调节抗氧化途径保护脑缺血再灌注引起的神经损伤。关键词缺血再灌注;抗氧化;槲皮素;神经保护中图分类号R285.5文献标识码A文章编号2095-0616（2022）01-0024-04ProtectiveeffectofquercetinonfocalcerebralischemiareperfusioninjuryinratsLINXuemei1，2WANGXiaolin1，2TANGChunhong21.Sectiono

3、fPathologyTeachingandResearch，NorthSichuanMedicalCollege，Sichuan，Nanchong637000，China;2.DepartmentofPathology，AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege，Sichuan，Nanchong637000，ChinaAbstractObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectandmechanismofquercetinonfocalcerebralischemia-reperfusioninjuryin

4、rats.MethodsAtotalof54maleSDratswererandomlydividedinto3groups，whichweretheshamoperationgroup，theischemia-reperfusiongroup，andtheischemia-reperfusionplusquercetingroup.Themodeloffocalcerebralischemiainratswithmiddlecerebralarteryocclusionwasmadebysuturemethod，andthemodelwasischemiafor2handreperfusio

5、nfor24h.Intheshamoperationgroup，onlycommoncarotidarterywasexposedandsutured.Ratsintheischemia-reperfusionplusquercetingroupwereinjectedwithquercetin50mg/kgintraperitoneallyafterischemiafor30min，whileratsintheshamoperationgroupandtheischemia-reperfusiongroupweretreatedwiththesamevolumeofsolventinthes

6、ameway.24hafterreperfusion，theneurologicalfunctionandwatercontentofbraintissuewereevaluated，themorphologicalchangesofbraintissuewereobserved，thehomogenateofbraintissuewasprepared，andtheactivityofsuperoxidedismutase（SOD）andthecontentsofmalondialdehyde（MDA）inbraintissueweredetected.ResultsAfterintrape

7、ritonealinjectionofquercetin，theneurologicalfunctionscoreofratsdecreased，thewatercontentofbraintissuedescended，theactivityofSODinbraintissueincreased，thecontentofMDAdecreasedandthedamageofbraintissuealleviated，withstatisticallysignificantdifferences（P0.05）.ConclusionQuercetincanprotectneurologicalin

8、jurycausedbycerebralischemia-reperfusionbyregulatingantioxidantpathway.KeywordsIschemia-reperfusion;Antioxidant;Quercetin;Neuroprotection缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損伤是指器官血流减少或中断，随后血流再灌注及细胞复氧，从而引起组织细胞损伤1-2，这一损伤过程涉及氧自由基的生成3、钙离子内流4、补体激活5、toll样受体激活和炎症反应6-9等多种复杂机制。槲皮素作为一种强自由基清除剂10，不断地被用于全身各器官缺血再灌注损伤模

9、型保护性研究，包括心、肝、肾、睾丸、骨骼肌等11。实验数据表明槲皮素可通过多种途径发挥脑缺血再灌注损伤保护作用，包括激活凋亡信号调节激酶1（apoptosissignal-regulatingkinase1，ASK1）/c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminalkinase，JNK）途径抑制神经细胞凋亡12、减少白介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎症递质抑制炎症反应13、下调基质金属蛋白酶9（matrixmetalloproteinase，MMP-9）维持血脑屏障完整性14及以提高脑组织内硫氧还蛋白含量发挥抗氧化应激15等。虽然槲皮素已经被运用于脑缺血再灌注损伤的

10、保护作用及机制研究，但相关治疗临床前研究指南指出，在脑缺血性损伤的药物研究中应选择多重指标16。故本研究采用局灶性脑缺血再灌注损伤模型，观察槲皮素对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。1材料与方法1.1实验动物和主要试剂雄性SD大鼠由川北医学院实验动物中心提供，重量为250300g。槲皮素购自美国Sigma-Aldrich，纯度98%。超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒均购自南京建成生物技术有限公司。1.2药物和实验动物的准备雄性SD大鼠54只，随机分成三组：假手术组、缺血再灌注组、缺血再灌注+槲皮素

11、组，每组各18只。将槲皮素溶解于二甲基亚砜，配制药物浓度50mg/ml备用。按50mg/kg剂量在缺血30min后经腹腔注射给予缺血再灌注+槲皮素组大鼠药物，假手术组和缺血再灌注组则按相同方式给予等体积溶剂。1.3动物模型的制备用线栓法制备动物模型。用石蜡包裹、头端呈梭形的0.24mm鱼线做线栓。术前禁食12h，自由饮水，腹腔注射0.35%水合氯醛麻醉（0.1ml/kg）大鼠，暴露左侧颈总动脉，在颈总动脉壁剪一破口，线栓经破口插入颈内动脉，过颈动脉分叉处继续进线约2cm时稍感阻力，提示线栓已经到达左侧大脑中动脉并阻断大鼠左侧大脑中动脉血流，造成大鼠左侧脑组织缺血性损伤。随即将线栓固定在颈总动脉

12、，缝合伤口。栓塞缺血2h后退出线栓再灌注24h。假手术组大鼠仅暴露左侧颈总动脉后缝合。1.4神经功能评分再灌注24h后，根据Zea-longa评分标准15观察大鼠行为学变化并评分：无神经缺损症状为0分;不能伸展右侧前爪为1分;行走时向右侧转圈为2分;行走时向右侧倾倒为3分;不能自发行走，意识丧失为4分。13分为有效模型。1.5脑组织含水量测定每组6只，大鼠脑缺血再灌注24h后，断头取脑，去除脑表面的硬脊膜、小脑及脑干部分，立即用微量精密天平称取大脑组织重量，然后放入烘箱，80烘72h至恒重，称取干重。脑含水量=（脑湿重-脑干重）/脑湿重100%。1.6大鼠脑皮质形态学观察每组6只，大鼠脑缺血再

13、灌注24h后，断头取脑，10%福尔马林溶液固定24h，取材、固定、脱水、包埋、3m切片后行苏木素-尹红染色。1.7脑组织内SOD活性及MDA含量测定每组6只，大鼠脑缺血再灌注24h后，断头取脑，剪取少量颜色晦暗、肿胀区域（即梗死区）脑组织称重，然后置于匀浆器中进行手工匀浆，制备10%脑组织匀浆，2000r/min离心15min，取其上清液，参照南京建成生物技术有限公司试剂盒操作说明检测脑组织匀浆中SOD活性及MDA含量。1.8统计学处理2结果2.1槲皮素对各组大鼠神经功能评分及脑组织含水量的影响与缺血再灌注组比较，腹腔注射50mg/kg槲皮素能显著降低大鼠神经功能评分及脑含水量，差异有统计学意

14、义（P0.05）。见表1。2.2槲皮素对各组大鼠脑组织SOD活性及MDA含量的影响与缺血再灌注组比较，腹腔注射50mg/kg槲皮素能显著提高脑组织内SOD活性及降低MDA含量，差异有统计学意义（P0.01）。见表1。2.3槲皮素对各组大鼠脑皮质形态学改变的影响假手术组大鼠脑皮质细胞排列整齐、形态结构正常、组织间质均匀红染无异常。缺血再灌注组大鼠脑皮质细胞数量减少、排列紊乱、可见核固缩及细胞水肿、组织间质内网状结构疏松淡染、并见小空泡。与缺血再灌注组比较，腹腔注射50mg/kg槲皮素后，大鼠脑皮质细胞数量增多、密度增加，发生核固缩和水肿的细胞数量均减少，组织间质水肿程度减轻。见图1。3讨论槲皮素

15、是一种天然黄酮类化合物，廣泛存在于各种蔬菜水果中，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化、抗感染、抗肿瘤、扩张血管、治疗代谢性和心血管疾病等多种药用价值17。研究表明其对脑缺血再灌注损伤具有保护作用，但根据相关治疗临床前研究指南，在脑缺血性损伤的药物研究中除了选择多重指标外，其评价应包括组织和行为学结果16。发生脑缺血再灌注时，血管通透性增强，血管源性脑水肿形成;随着细胞复氧，线粒体功能受损，活性氧生成增加，从而诱导一系列氧化应激反应，导致细胞水肿、凋亡甚至梗死18，故而动物可出现一系列异常的神经行为学表现。因此，本研究量化统计大鼠神经功能评分、评价脑组织含水量、观察脑组织形态学变化，可以反映大鼠脑缺血再灌

16、注的损伤程度。与缺血再灌注组比较，腹腔注射槲皮素后，大鼠神经功能评分和脑组织含水量均明显下降。提示槲皮素能改善脑缺血再灌注损伤引起的神经功能损害及脑水肿。此外，发生脑缺血再灌注损伤后，脑组织损伤体现为细胞数量减少、核固缩、细胞水肿，脑组织间质内网状结构疏松淡染及小空泡形成。而腹腔注射槲皮素后，脑皮质细胞数量增多、密度增加、核固缩和水肿细胞数量均减少，脑组织间质水肿程度减轻，这些形态学改变与大鼠的神经功能评分及脑组织含水量改变趋势是一致的，提示槲皮素可减轻脑缺血再灌注损伤引起的损伤。脑缺血再灌注损伤机制复杂，其中内源性抗氧化因子减少、氧自由基增加以及随后的氧化应激被认为在缺血再灌注中起着关键作用

17、。氧自由基能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化作用，形成脂质过氧化物，包括MDA、酮基、羟基等。因此，MDA含量高低可反映脂质过氧化程度。而SOD可通过歧化反应清除体内生成的氧自由基、阻断脂质过氧化连锁反应，保护细胞免受损伤19，其活性高低可反映机体清除氧自由基的能力。与缺血再灌注组比较，本研究结果提示，槲皮素能显著提高SOD活性、降低MDA含量，提示槲皮素对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护机制可能与其抗氧化特性有关。综上所述，槲皮素可改善大鼠局灶性脑缺血再灌注后引起的神经功能损害，减轻脑水肿及脑组织损害程度，提高内源性抗氧化酶活性，降低脂质过氧化反应，从而发挥神经保护作用。参考文献1Wa

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