灯盏细辛对神经细胞尼古丁受体表达的影响及其神经保护作用研究

1、灯盏细辛对神经细胞尼古丁受体表达的影响及其神经庇护作用研究齐晓岚，黄勇，王永林，王爱民，官志忠【摘要】目的研究中药灯盏细辛对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞神经型尼古丁受体表达的影响及其对抗淀粉样卵白A神经毒性作用机制。要领接纳比色法测定细胞TT复原率挑选药物浓度宁静范畴，拔取必然浓度的灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位处置惩罚SH-SY5Y细胞后，再参加A1-42处置惩罚，测定TT复原率，卵白质印迹法esternbltting要领测定神经型尼古丁受体3、7卵白表达的变革；接纳革新的Ellan比色法测定细胞造就基中乙酰胆碱酯酶Aetylhlinesterase，AhE及丁酰胆碱酯酶Butyrylhl

2、inesterase，BuhE活性。效果灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位能进步细胞3及7尼古丁受体亚单元卵白质表达程度；低落细胞乙酰胆碱酯酶活性；并能对抗A引起的TT复原率低落。结论灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位能上调尼古丁受体亚单元卵白表达程度，低落细胞乙酰胆碱酯酶活性，且能对抗A的神经毒性作用，在阿尔茨海默氏病的治疗中大概起到必然作用。【关键词】灯盏细辛；SH-SY5Y细胞；尼古丁受体；-淀粉样卵白；胆碱酯酶；阿尔茨海默氏病Abstrat：bjetiveTinvestigatetheeffetsfHerbaErigertisntheexpressinfnitiniaetylhlinereep

3、tr(nAhR)andtheanti-neurtxiityehanisfthedrugbyusingneurblastaSH-SY5Yellstreatedithbeta-aylidpeptide.ethdsTheSH-SY5YellseretreatedbyHerbaErigeritis,andthenexpsedtA1-42.TTredutinassayasusedthsasafe-dsenentratinfHerbaErigeritisandtunderstandtheinfluenesfthedrugsnellularviabilityresultedfrthetreatentfA;e

4、xpressinsf3and7nAhRsubunitsatprtEinleveleredetetedbyestern-bltting.Thelevelsfaetylhlinesterase(AhE)andbutyrylhlinesterase(BuhE)ativitiesinellultureediusereeaturedbyaniprvedEllanslrietriethd.ResultsHerbaErigertisstiulatedinreasesf7and3nAhRprteinsintheulturedells;dereasedtheativityfAhEandinhibitedthed

5、ereasedTTredutinresultedfrA.nlusinHerbaErigertisanupregulatetheexpressinfnAhRsubunitsatprteinlevel,dereasetheativityfAhEandpreventthedereasedTTredutininduedbyA.ThedrugsightplayaniprtantrleintherapeutistrategyfAD.Keyrds：SH-SY5Yells;nAhR;-aylidpepitide;Alzheierdisease;hlinesterase;HerbaErigertis阿尔茨海默氏

6、病Alzheiersdisease，简称AD是一种重要在老年期产生的以举行性痴呆为重要特性的神经元退行性变疾病，其重要临床表现为举行性认知成效停滞、影象力阑珊、性格和举动改变等13。近一个世纪以来，浩繁的科学家就AD的病因及发病机制举行了大量的研究，但其发病机制至今尚不非常明晰。如今以为AD是由遗传学因素、情况因素和代谢因素等多种因素配合作用所引起的一种疾病，病理学上以脑细胞内神经原纤维缠结及细胞外老年斑形成为重要特性1。老年斑的重要身分为淀粉样卵白，是一种神经毒性物质，可以引起神经元的损伤和殒命，是AD发病历程中的一个紧张因素，能促进AD的产生和生长。神经型尼古丁乙酰胆碱受体(Nitinia

7、etylhlinereeptr,nAhR)或称尼古丁受体与学习和影象等认知成效严密相干，并具有显着的神经庇护作用4。在较早的一些研究中就创造，AD患者大脑皮层nAhR出现连续和严峻的丧失，大脑皮层nAhR缺失与AD患者认知停滞有明显的相干性。胆碱酯酶hlinestease，hE是一类丝氨酸水解酶，其成效重要为水解快乐性神经递质乙酰胆碱。可分为两类，乙酰胆碱酯酶Aetylhlinesterase,AhE与丁酰胆碱酯酶Butyrylhlinesterase，BuhE。近几年的研究表白，AhE和BuhE在AD的发病历程中起着紧张的作用，且它们的水解底物Ah缺失的严峻程度与痴呆严密相干5。在AD病人脑

8、中，总AhE的酶活性是落落的，然而在老年斑中以及其四周AhE活性却是升高的，其能促进A的聚拢，并加快其沉淀，形成不成溶的淀粉样斑块6。由于AD的发病机制庞大，只管天下各国在探求有用治疗药物的研究中投入了大量人力和物力，但效果却非常有限，如今天下上最为成熟和乐成的要领是接纳胆碱酯酶按捺剂hlinesteaseinhibitr，hEI，以进步患者脑内Ah的程度、赔偿胆碱能成效的缺失，也是唯逐一种通过美国FDA容许用于治疗AD的药物7。但是，胆碱酯酶按捺剂只能缓解AD的临床病症，而无法到达根治的作用。中药是我国奇特的资源，在治疗上具有多途径、多靶点、毒副作用较小等特点，中医药学从团体不雅念动身，辨证

9、论治，并积聚了富厚的履历。灯盏细辛具有抗血栓,抗缺血,脑缺血再灌注神经损伤庇护作用，且灯盏细辛乙醇提取物表现-淀粉样肽聚拢按捺活性8。本研究用A1-42处置惩罚泉源于人脑的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞作为研究工具，以研究灯盏细辛神经庇护作用机制。1试剂及样品灯盏细辛由贵阳医学院药学院制备、提供，灯盏药材以95乙醇提取2次，接纳乙醇后，以水混悬，取样。混悬水溶液醋酸乙酯萃取数次，醋酸乙酯层归并接纳溶剂得灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位。D-E造就液购自GibInvitrgen公司英国；源于人脑的神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞购于Geranlletinfirrganissandellultu

10、res公司德国；羊抗3、7及鼠抗-肌动卵白-atin多克隆抗体及HRP标识表记标帜的抗羊及抗鼠二抗购自SantaruzBitehnlgyIn(美国)。聚乙烯二氟PVDF膜、EL-Plus发光试剂、高效显影胶片购自Aersha公司；胆碱酯酶测定试剂及别的化学试剂均购自Siga公司。2要领2.1细胞造就，-淀粉样肽及灯盏细辛的处置惩罚先用含15胎牛血清的DE造就液造就SH-SY5Y细胞，待细胞生长不变后，改用不含血清的DE造就液继承造就，造就箱中含5%2，温度为37。在SH-SY5Y细胞中参加1l/L的A1-42，造就48h。为不雅察灯盏细辛对A毒性作用的影响，先参加3g/L灯盏细辛乙醇提取物醋酸

11、乙酯部位造就24h后，再参加1l/LA1-42造就48h。2.23-4,5-二甲基噻唑-2,5-二酚四唑溴化物3-(4,5-diethylthiazl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazliubride,TT测定TT是一种四甲基偶氮唑盐，经活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶催化可天生蓝紫色的复原型TT，该产物在490n波优点有极大的汲取峰。比色法测定TT程度9，常用来表现细胞的损伤程度和成效状态。为挑选灯盏细辛的宁静浓度，选择0.0510g/l浓度处置惩罚SH-SY5Y细胞后24h后测定TT复原率，以检测其对细胞是否具有毒性作用及其宁静浓度范畴。2.3尼古丁受体亚单元卵白表达测定参照Gua

12、n等10的要领举行提取细胞膜卵白及用西印迹esternbltting要领检测3，7nAhR亚单元卵白程度。以Labrks软件阐发效果时以-Atin卵白条带作为内参照，盘算3、7nAhR卵白条带与-Atin卵白条带像素灰度的百分比值作为3、7nAhR卵白质表达的相对程度比。2.4体外造就的细胞胆碱酯酶活性测定网络细胞造就基，参加的造就基量根据卵白定量的效果使其含有雷同的卵白质克数。96孔酶标板每孔总体系为200l，每孔加造就基10l，按表1加样。表1细胞胆碱酯酶活性测定略于室温避光处正确反响15in后，在酶标仪412n波长下比色。盘算公式为：AhE或BuhE活性单元=2.941D测定值-比拟值3

13、效果3.1中药宁静浓度筛查灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位在所选浓度范畴内对SH-SY5Y神经细胞TT复原率无显着影响，表白其对细胞毒性作用较校因此选择3g/l作为本次研究灯盏细辛的选用浓度图1。图1经差异浓度灯盏细辛乙醇提取物乙酸乙酯部位处置惩罚的SH-SY5Y神经细胞TT复原率略3.2药物处置惩罚后TT复原率测定药物处置惩罚后TT复原率测定创造，1l/LA1-42处置惩罚细胞后引起TT复原率显着低落；3g/l灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位处置惩罚细胞不影响细胞成效；而用灯盏细辛预处置惩罚细胞后可显着削弱A对细胞的毒性作用，A组与灯盏细辛+A组之间的差异有统计学意义P0.05。见图2。3.3尼

14、古丁受体亚单元卵白表达程度3及7nAhR亚单元卵白质表达程度效果表白，灯盏细辛处置惩罚细胞可上调细胞3及7nAhR亚单元卵白质表达程度P0.01。见图3。3.4细胞胆碱酯酶测定效果细胞经3g/l灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位处置惩罚组AhE活性值为11.691.21nlin-1l-1，较空缺比拟组的15.860.47nlin-1l-1低落26.29，差异存在统计学意义P0.05。遍地理组BuhE活性值别离为：空缺比拟组10.880.33nlin-1l-1，灯盏细辛乙醇提取物处置惩罚组11.161.23nlin-1l-1。两组间BuhE活性值差异无统计学意义P0.05。SH-SY5Y神经细胞经灯

15、盏细辛及A处置惩罚后TT复原率测定，效果用单因素方差阐发法统计阐发(n=6)，*表现与比拟组比拟差异有统计学意义P0.01；表现与A处置惩罚组比拟差异有统计学意义P0.05。n：比拟组；A：A处置惩罚组，DZXX：单纯灯盏细辛处置惩罚组，DZXX+A：灯盏细辛和A处置惩罚组图2SH-SY5Y神经细胞药物处置惩罚后TT复原率略SHSY5Y细胞经灯盏细辛处置惩罚后，用esternbltting法测定SH-SY5Y神经细胞3及a7尼古丁受体亚单元卵白质表达程度，效果用单因素方差阐发法统计阐发(n=6)，*表现与比拟组比拟差异有统计学意义P0.01。n：比拟组，DZXX：灯盏细辛处置惩罚组图3SH-S

16、Y5Y神经细胞药物处置惩罚后3及7尼古丁受体亚单元卵白质表达程度略4讨论大量研究已经证明在AD脑构造中老年斑的重要身分A是由其前体卵白-Aylidpreursrpeptide,APP经排泄酶-和-水解后形成的，具有必然的神经毒性作用。迩来也有研究表白，A的损伤作用是AD产生生长的重要因素11。本研究用A1-42处置惩罚泉源于人类的SH-SY5Y神经细胞，模拟AD患者脑内神经细胞的病理历程，以此作为灯盏细辛体外研究的类AD细胞模子。研究效果表现，与比拟组比拟，A1-42处置惩罚组SH-SY5Y神经细胞的TT复原率显着低落，进一步证明A-可引起神经细胞的损伤。实行还创造，灯盏细辛预处置惩罚的SH-

17、SY5Y神经细胞可以或许对抗A引起的TT复原率低落，进一步表白该中药具有抗A细胞毒性的作用。神经型尼古丁受体是神经体系中一类非第2信使介导性神经递质结合的离子通道，与学习和影象干系严密，是一类明白的具有神经庇护成效的受体，其淘汰与AD的产生有关12。AD病人脑内尼古丁受体-配体结合率低落，其亚基的卵白表达程度也低落13。如今探求可上调nAhR且副作用小的药物是治疗AD药物研究的标的目的之一。在SH-SY5Y神经细胞中，a3和a7是重要的尼古丁受体亚类。本研究中，通过测定nAhR3和7亚单元卵白质程度创造，灯盏细辛乙醇提取物可以或许显着地上调3和7nAhRs卵白质的表达程度，说明在治疗AD药物的选择中灯盏细辛大概具有紧张的作用。hE能通过水解胆碱而发挥生理成效。中枢神经体系的AhE及胆碱能受体到场完成神经与神经之间行动电位的通报历程，AhE能敏捷水解乙酰胆碱Aetylhline，Ah天生胆碱和乙酸，发挥停顿神经冲动通报的作用5。近几年的研究表白，AhE和BuhE在AD的发病历程中起着紧张的作用，它们的水解底物Ah缺失的严峻程度与痴呆严密相干14。AD病人脑中总体的AhE活性落落，然而在老年斑中以及其四周AhE活性却是升高的